一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的新型多功能可吸收手术缝合线

本发明属于生物医药，具体涉及一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的新型多功能可吸收手术缝合线。

背景技术：

1、随着化学工业的发展，一系列以聚酰胺、聚丙烯、聚乙交酯等为原料的缝合线被开发出来，并因其优异的力学性能和生物相容性而广泛应用。

2、在临床手术中需针对不同伤口匹配最合适的缝合线，按照是否可被吸收，可以分为不可吸收和可吸收缝合线。天然缝合线中真丝缝合线即蚕丝依然在临床中使用。然而蚕丝作为一种蛋白质纤维，在缝合过程引发细菌生长，并且其本身的编织结构中缝隙更容易粘附细菌造成伤口感染，影响伤口的愈合。

3、可吸收缝合线常用的材料为聚对二氧环己酮（poly-p-dioxanone, ppdo）、聚己内酯（polycaprolactone, pcl）、聚乙醇酸（polyglycolicacid, pga）及其共聚物等。其中，ppdo是以对二氧杂环己酮（p-dioxanone，pdo）为原料，经开环聚合得到的脂肪族聚酯，具有无毒，生物相容性好，良好的生物降解和柔韧性，机械强度高等特点，适用于愈合时间较长的伤口。由于是柔性较差，体内环境中强度下降速度太快，现多跟丙交酯共聚使用。虽然缝合线的材质多种多样，然而目前还没有一种材质可以同时满足医疗手术中机械性能的需要。缝合线在使用过程中难免会出现副作用，即造成术后感染。

4、随着世界范围内缝合线的不断研究，缝合线，如载药线、抗菌缝线等的发展，为其在生物医药领域的发展提供了新的方向，具有广阔的发展前景。chen 等人将丝线浸渍在含有左氧氟沙星盐酸盐的聚己内酯涂层，所得到的缝合线对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都表现出优异的抗菌效果，并能够有效防止细菌粘附。zhang等人在缝合线负载壳聚糖/明胶-单宁酸（cs/ge-ta）来制备多功能缝合线ta100，ta100表现出优异的抗炎和抗菌性能。

5、为了满足临床更好的缝合效果，科研人员研究出了带倒刺可吸收缝合线。倒刺型缝线在缝线表面呈一定的纵向取向排列，使缝线与组织发生“锚定”作用，即缝线在缝线反向运动时不会自由运动，通过去除线结、分散伤口张力，进一步提高缝合效率。另外，倒刺式缝线应力分布均匀，操作简便快速。同时，倒刺缝合线和光滑缝合线性能相近，但倒刺缝合线在8星期内（完全降解的时间超过24星期）为组织提供一定的力学支撑性，更适用于需要长时间（在8星期内）修复愈合的组织。因此，开发抗菌可吸收缝合线，为避免伤口感染、促进伤口愈合具有重要的临床意义。

6、人体的皮肤、动脉、韧带等组织中广泛存在着一种对组织的弹性运动及抗形变能力起着至关重要的作用的蛋白—弹性蛋白（elastin）。弹性蛋白具有良好的生物相容性，可以调节细胞的功能，如促进细胞增殖分化和迁移等。弹性蛋白序列有疏水与亲水两类结构域。目前普遍认为，弹性蛋白是通过其疏水性结构域与细胞发生相互作用的。天然弹性蛋白被广泛应用再医学组织工程，类弹性蛋白因其优良的性能也被广泛应用。urry实验室基于天然牛弹性蛋白疏水区域合成类弹性蛋白（elastin-like proteins，elps），其主要由短小重复的序列vpgxg(x是除pro以外的任何一种氨基酸)串联而成。因而，可根据需求，将具有不同功能的氨基酸序列引入多肽序列来设计构建相应的 elps具有更好的应用前景。elps是通过基因工程手段获得的一种蛋白，但依旧保留着天然弹性蛋白的部分活性—在生理条件下自组装的特性以及经典的温度敏感特性，有着可逆相变的行为。

7、elps主要采用天然提取、化学合成和重组dna技术方法获得。然而，从动物源提取的天然弹性蛋白存在免疫原性和病毒风险，且序列单一；而化学合成的弹性多肽虽具潜力，却受制于其多肽链长度和合成条件的难以控制，以及高昂的成本的挑战。因而，重组dna技术结合基因工程合成具有特定分子量的较大elp聚合物成为了最便捷的方法。该方法制备弹性蛋白成本低，易于大规模生产以及消除免疫及病毒风险等优势。此外，elps很容易在大肠杆菌（e. coli）中以质粒携带的基因形式表达，产量相对较高(生长速度可达500 mg/l)。

8、elps因氨基酸序列具有简单可控性、温度相转变性以及良好的溶解性、优异的生物相容性等突出特点，在形成水凝胶和网络支架方面显示出巨大潜力，使得它们成为促进细胞附着和增殖的理想选择，在细胞培养、组织再生等生物医学领域得到了广泛应用。此外，其水凝胶形态在药物控制释放过程中也扮演着重要角色，为药物递送提供了新的解决方案。先前的研究发现elps具有良好的生物相容性，将带有良好生物活性的elps负载到缝合线中，在手术后增加组织相容性，促进伤口愈合。然而仅仅通过浸泡蛋白的方式不能有效的将弹性蛋白负载其中，故利用多巴胺作为中间体，将其首先化学负载在可吸收缝合线中，再利用多巴胺（dopamine，da）黏附蛋白负载在线上。da是由海洋贻贝产生的分子，在弱碱、有氧等环境下可以氧化聚合，生成聚多巴胺（polydopamine，pda）。pda上的邻苯二酚结构，具有较强的反应活性，无论固体材料的表面化学性质如何，都能负载其中，有利于修饰和改性各种支架材料，赋予其多种生物学功能，如促进细胞增殖黏附、组织再生等。带有pda涂层的生物材料因其优异的性能，已广泛应用于各种组织工程领域。gao等将pda负载到plga多孔微球上，制备plga-pda多孔微球。这些微球能够有效地吸附外泌体，并且在治疗部位表现出较高的外泌体保留率。此外，它们维持了外泌体的释放21天，并有效地诱导了大鼠颅骨缺损的血管化骨再生。wei等设计了一种由添加了甲泼尼龙聚合物内核和聚多巴胺外壳组成的微复合材料，研究发现，该材料可以在脊髓损伤后1天内以广谱方式有效地中和了过多的细胞因子且有效的减少了新炎性细胞因子的分泌，阻止了巨噬细胞的募集并保护了受伤的脊髓，有助于运动功能的恢复。

9、为了使缝合线不仅在增强细胞生长，组织再生等方面起作用，而且在防止创面感染以及去除疤痕方面发挥作用，使缝合线具有抗菌抗疤痕作用也成为了临床手术治疗的需求。抗菌药物三氯生（triclosan，tcs）是一种可以减少伤口感染的强效药物，通过抑制细菌生长过程的的脂肪酸合成而对许多常见的细菌都有的抑制作用。三氯生因其优秀的抗菌效果广泛应用到各类生物材料中，如负载三氯生到壳聚糖支撑粘合剂树脂。自2002年，美国食品和药物管理局认证带有三氯生涂层聚乳蛋910缝合材料可有效作为抗菌手术缝合线，带有三氯生涂层的缝合线应运而生。现有证据表明，带有三氯生涂层的缝合线抑菌效果明显，可以有效降低普外科腹部切口手术部位感染发生率，减少细菌感染。

10、槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于与蔬菜水果和中草药中，黄酮类化合物包含一个非常大的天然产物群，其特征是含有c6-c3-c6骨架结构。stat3信号通路对瘢痕疙瘩的形成有重要作用。以往的研究表明，槲皮素通过抑制stat3信号途径诱导原发性积液淋巴瘤细胞凋亡和自噬。槲皮素也可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中stat3和p-stat3蛋白表达水平，提示槲皮素可能通过抑制stat3信号通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增值。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的新型多功能可吸收手术缝合线，将抗菌类药物，促进愈合的重组人弹性蛋白以及抗疤痕药物通过多巴胺的方式负载于可吸收缝合线上。该缝合线不仅具备传统创面缝合作用，还具备抗菌抗疤痕促创面快速愈合等多种作用，可提高创面恢复周期以及去除疤痕的效率，而且可以防止创面感染。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的新型多功能可吸收手术缝合线，其特征在于，由可吸收缝合线、多巴胺、抗菌药物三氯生、重组人弹性蛋白和抗疤痕药物通过生物物理化学方式负载所得，多巴胺自氧化负载于可吸收缝合线后再混合抗菌药物三氯生、重组人弹性蛋白和抗疤痕药物，缝合线上的蛋白及药物负载量通过多巴胺溶液浸泡次数和时间来调节。

4、所述的药物为抗菌类药物和抗疤痕药物中的一种或是多种。

5、所述的缝合线为不同结构，可以是光滑可吸收缝合线也可以是倒刺可吸收缝合线。

6、所述负载方式是通过多巴胺自氧化成聚多巴胺的方式，具体包括以下步骤：首先将材料浸入多巴胺溶液（10 mm tris 缓冲液，ph=8.5）中，在37℃恒温培养箱中反应24h，以将聚多巴胺（pda）接合在缝合线表面上，接着，用ddh2o洗涤三次，为了去除未附着的多巴胺，每次洗涤进行超声处理5min，获得pda@缝合线，之后依次浸泡蛋白溶液和药物溶液，随后风干，即可得到一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的多功能可吸收手术缝合线。

7、所述的重组人弹性蛋白可以增强药物负载，也可增强吸收缝合线的粘附性，促进表皮及内皮细胞增殖。

8、所述的三氯生是抗菌类药物的一种或者是抗菌蛋白类药物的一种。

9、所述的抗菌类药物为三氯生、环丙沙星、氧氟沙星、利福平青霉素、阿莫西林中的一种。

10、所述的槲皮素是抗疤痕药物的一种。

11、所述的重组人弹性蛋白成分中包括弹性蛋白和标签蛋白，其中起到纯化作用的标签蛋白为his标签、sumo标签或gst标签中的一种或多种；其中弹性蛋白是重组人源全长或者部分功能域的天然弹性蛋白也可以是重组人源类弹性蛋白。

12、所述的重组人弹性蛋白可以是重组人源类弹性蛋白，类弹性蛋白可以是部分功能域的天然弹性蛋白的重复序列或是天然弹性蛋白多肽的重复序列。

13、所述的重组人弹性蛋白的制备包括以下步骤：

14、包括以下步骤：

15、第一步：将设计好的重组人弹性蛋白的基因序列进行合成；

16、第二步：将合成的基因片段和载体pet28a(+)进行双酶切；

17、第三步：通过胶回收将双酶切后的目的片段进行回收；

18、第四步：将回收的目的片段进行连接，随后进行涂板筛选获取阳性克隆，测序以检测完全正确；

19、第五步：将测序正确的阳性克隆摇菌并提取质粒，并通过热激的方式导入到大肠杆菌的感受态（bl21(de3)）中进行涂板培养,该感受态能进行蛋白的表达；

20、第六步：挑取转化涂板后的菌落进行培养，待菌液od600在0.6-0.8添加iptg诱导剂进行诱导4-6h，随后收集菌液离心获取菌泥备用；

21、第七步：将菌泥裂解，超声破碎，根据蛋白是否在上清或是沉淀选择不同的纯化方式进行蛋白分离纯化；

22、第八步：纯化后的蛋白进行脱盐处理，并且通过冷冻干燥获取冻干的蛋白。

23、所述的载体在体外还可选取其他原核表达载体或是真核表达载体，表达宿主随表达载体的不同选择原核生物细胞和真核生物细胞。

24、一种负载重组人弹性蛋白、槲皮素及三氯生的多功能可吸收手术缝合线在皮肤紧致，创面恢复以及创面去除疤痕中的应用。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

26、本发明改良后的可吸收缝合线生物相容性良好，在动物功能性和安全性实验中无死亡病例，且细胞增殖等相对对照组无明显差异，组织无坏死症状；本发明改良后的可吸收缝合线，能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，对组织内感染有显著的降低作用，对于创面修复有积极的促进作用；本发明改良后的可吸收缝合线，能抑制瘢痕形成，还能紧致皮肤的同时防止感染；本发明能降低术后创面以及损伤创面的感染风险，并能加快创面恢复的进程。本发明在皮肤紧致，创面恢复以及创面去除疤痕等领域具有重要意义。