一种促进牙周膜干细胞分化成骨的PCL-PEG-HAAM复合支架及其制备方法

本发明涉及牙周组织再生材料，尤其涉及一种促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架及其制备方法。

背景技术：

1、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，pdlscs)是一类存在于牙周韧带中的牙源性间充质干细胞，它们具有较高的自我更新能力和多谱系分化潜力，pdlscs在维持牙周稳态方面起着至关重要的作用；在适当的体外诱导条件下，pdlscs可以分化成不同的细胞谱系，如成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。在各种用于牙周再生的间充质干细胞中，pdlscs已被证明能在体内形成新的牙骨质样结构，此外，pdlscs来源丰富、容易获取及涉及较小的医学伦理，是牙周组织再生研究中重要的种子细胞候选者。

2、近年来，可生物降解合成聚合物材料因价格低廉、可规模化生产、低毒性以及可通过化学修饰灵活控制和微调支架的特性，已广泛应用于血管、骨、牙周等组织的再生研究。其中，聚己内酯(polycaprolactone，pcl)的缓慢降解为骨组织再生提供了足够的时间和不会在体内产生过酸的环境，而成为骨组织再生中使用最广泛的聚合物之一；聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)是聚合物中最常用的生物相容性改性剂之一，具有良好的亲水性、生物相容性，且无排斥反应，其适当添加可以用于增强材料表面的亲水性。因此，添加了peg的pcl制成的静电纺丝纳米纤维有望对细胞更具亲水性和友好性，而不会产生毒性或降解负担。然而，与天然细胞外基质相比，它们缺乏细胞的天然活性功能位点，生物活性较低，体内排斥率增加，通常不能达到理想的骨再生效果。

3、人羊膜(human amniotic membrane，ham)是由单层人羊膜上皮层、基底膜及无血管基质层构成厚度约0.02-0.5mm的半透明薄膜，分泌多种生长因子、细胞因子及细胞外基质蛋白，具有抗炎、抗菌、抗纤维化等优点，ham已被广泛应用于眼外伤与皮肤外伤的修复。此外，研究表明ham能促进骨再生，然而，细胞的存在令ham在使用上存在一些局限性，如移植物排斥反应、储存困难及保质期短等；为了克服这一问题，通过对ham进行脱细胞保留天然的细胞外基质，其主要成分包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、透明质酸、成纤维细胞生长因子和转化生长因子，不仅保留了其原始功能，还降低了免疫原性，理论上，与ham相比，人脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane，haam)是一种更安全有效的支架材料，作为细胞外基质负载细胞构建工程化组织器官，还能在细胞因子或生长因子的递送中发挥作用，提供这些物质的受控释放以促进愈合和再生，但因其降解速率过快和低机械性能在骨组织再生中受到限制。

4、组织再生策略在于制造具有生物相容性、安全无毒和生物活性的材料来促进牙周组织再生。目前研究将合成聚合物优异的机械特性与天然细胞外基质的生物活性相结合的仿生复合材料在组织再生中引起了关注，但现有技术中未见将haam与pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜联合应用于pdlscs成骨分化的相关研究报道。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架及其制备方法。

2、第一方面，本发明提供了一种促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

3、得到冻干haam；

4、得到pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜；

5、向所述pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜表面涂覆明胶，得到第一pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜；

6、将所述冻干haam平铺于所述第一pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜表面，后进行压实，得到所述pcl-peg-haam复合支架。

7、进一步地，以重量百分数计，所述明胶的涂覆量占所述pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜重量的0.1％。

8、进一步地，所述pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜和所述haam的尺寸大小相同；所述尺寸大小为4cm×4cm。

9、进一步地，所述压实的工作过程：使用滚轮加压将pcl-peg和haam两者紧密粘附在一起，排除两者之间的气泡，置于超净台风干过夜。

10、进一步地，所述得到冻干haam的步骤包括一下过程：

11、获取ham；

12、采用pbs对所述ham进行漂洗，随后放入含2wt％三抗的pbs浸泡30min，将新鲜ham放在含5wt％triton x-100溶液的50ml离心管，添加的5wt％triton x-100溶液为组织体积的2倍，放入气浴恒温水浴箱37℃下振荡处理1h，取出后用pbs溶液漂洗4-5次，然后加入含0.25wt％胰蛋白酶的离心管中，放入气浴恒温水浴箱37℃下振荡处理1h，胰蛋白酶体积为组织体积的2倍，取出后再用pbs溶液漂洗4-5次，随即利用细胞刮刀轻刮羊膜上皮面，刮完后用pbs溶液漂洗4-5次，去除残留的细胞，得到所述haam；

13、将所述haam置于无菌弯盘中进行修剪，羊膜上皮层朝上，放入10cm培养皿中，置于-80℃冰箱过夜，第2日进行冷冻干燥，冻干时间为8h，得到所述冻干haam。

14、进一步地，所述得到pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜的步骤包括以下过程：

15、采用静电纺丝机制备静电纺丝纳米纤维，天平分别称取0.9g pcl和0.1g peg倒入8ml由体积比为1:4的酒精和六氟异丙醇组成的溶剂中，在室温条件下，将溶剂放置于磁力搅拌器上搅拌16h后，全部吸入到10ml注射器中，固定在静电纺丝机上，设定接收距离为20cm、电压7kv、推进速度0.8ml/h，并收集在铝箔纸上，得到pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜，将纤维膜放入37℃烘箱中干燥48小时以去除溶剂，保存备用。

16、进一步地，所述pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜的厚度为140-160μm。

17、进一步地，所述haam的厚度为35-50μm。

18、第二方面，本发明提供了一种促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架，所述促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架是采用第一方面任一项所述的制备方法制得。

19、本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：

20、本发明实施例提供了一种促进牙周膜干细胞分化成骨的pcl-peg-haam复合支架及其制备方法，本发明首次将haam与pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜联合制备得到了一种聚己内酯-聚乙二醇-人脱细胞羊膜(polycaprolactone-polyethylene glycol-humanacellular amniotic membrane，pcl-peg-haam)复合支架，进一步探究了其物理性质以及对牙周膜干细胞的增殖、黏附及成骨分化的影响。主要结果如下：

21、1)通过he染色可以看到去除了羊膜上皮细胞及间充质细胞且完整地保留了ham的基底层和致密层，通过扫描电镜可以看到基底膜表面完整无剥脱，致密层可见直径大小不一的胶原纤维相互交织呈多孔的蜘蛛网状结构；通过扫描电镜可以看到复合支架为双层膜结构，两者间可见明显交界线，haam与下方呈“渔网状”的pcl-peg纳米纤维紧密连接；pcl-peg-haam复合支架的机械性能优于haam。

22、2)cck-8结果显示pcl-peg-haam组细胞增殖速率最高；pcl-peg-haam组的细胞粘附率高于pcl-peg组及haam组(p<0.05)。

23、3)bcip/nbt染色和茜素红染色结果显示pcl-peg、haam、pcl-peg-haam支架均能促进pdlscs的成骨分化，其中，pcl-peg-haam组染色面积最深最广；wb结果显示pcl-peg-haam组runx2、col1、alp成骨蛋白表达量显著高于空白对照组、pcl-peg组(p<0.05)。

24、综上所述，本发明提供的将haam与pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜联合制备得到的pcl-peg-haam复合支架不仅改善了haam的机械性能，而且促进了pdlscs增殖、黏附及成骨分化，将haam与pcl-peg静电纺丝纳米纤维膜膜联合使用，两者表现出显著的协同增效作用，为促进pdlscs成骨分化提供了一种新的生物材料。