一种NFAT1基因在制备用于诊断或治疗胰腺癌及肺纤维化的试剂盒

本发明涉及一种nfat1基因在制备用于诊断或治疗胰腺癌及肺纤维化的试剂盒,属于生物医药。
背景技术:
1、约90%的胰腺癌起源于腺管上皮的导管腺癌,缺乏有效的诊断标记物,胰腺癌隐匿性强,出现症状时肿瘤细胞已局部或者远端转移,5年生存率仅为12%。又因为胰腺的解剖位置特殊,使得放化疗或者手术治疗较为困难。因此,降低胰腺癌细胞的迁移和侵袭对癌症患者尤为重要。靶向治疗特异性的杀伤肿瘤细胞,通过识别、结合或抑制癌症相关的生物标志物抑制癌细胞的生长、凋亡和转移。迫切需要寻找调控胰腺癌转移的新靶点或者新的调控机制和信号通路。
2、活化t细胞核因子2(nuclear factor of activated t cells 2,nfat1),是活化t细胞(nfat)家族核因子的成员,是一种蛋白质编码基因。该基因在动物的多种组织器官中均有表达,其主要功能是作为激活t细胞转录复合物核因子,进而诱导下游基因的表达,从而发挥相应的功能。此外,nfat1在胃癌、肺癌、结直肠癌中均有高表达,并促进癌细胞的侵袭转移,是潜在的肿瘤治疗靶点。
3、细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transitionfactor,c-met),该基因是受体酪氨酸激酶家族的成员,c-met信号通路对胚胎发育和产后器官再生期间的侵袭性生长具有关键作用。通常成人只有在伤口愈合和组织再生的过程中c-met信号通路才被完全激活,但肿瘤c-met信号通路能被癌细胞频繁激活,促使肿瘤形成、侵袭性生长和转移,是潜在的肿瘤治疗靶点。
4、在胰腺导管腺癌pdac中,丰富的间质是其恶性化的部分原因。抗纤维化疗法在最近的研究中受到了广泛关注,在胰腺癌晚期发展过程中,其可能会通过血液循环或者淋巴系统转移到肺部,造成肺纤维化。肺纤维化是一种间质性肺疾病的末期表现,这种疾病以成纤维细胞增殖和大量的细胞外基质沉积为特征,导致肺组织结构的破坏,肺纤维化的生存率仅次于肺癌,生存期很短。近年来,有研究发现,用于肺纤维化的药物可以通过某种信号通路作用于胰腺癌肿瘤。
5、尽管有研究称,nfat1和c-met在多种癌组织中显著高表达,其可以作为潜在的肿瘤治疗靶点,但目前在胰腺癌和肺纤维化疾病中靶向nfat1进而关联c-met抑制其mrna和蛋白质水平从而降低胰腺癌细胞及肺上皮细胞的迁移能力对于胰腺癌和肺纤维化的治疗作用还未见报道。
技术实现思路
1、针对以上问题,本发明发现tcga数据库显示nfat1,c-met的高表达具有临床意义。nfat1和c-met抑制剂均显著抑制胰腺癌细胞cfpac-1和patu8988的迁移能力,且显著降低其活性。c-met和cd44蛋白随nfat1的抑制剂的抑制而下调,为paad的肿瘤预后及靶向治疗均提供新思路。除此之外,nfat1通过调控c-met可以抑制肺上皮细胞beas的迁移能力,为治疗肺纤维化提供了新的思路。
2、本发明所述的nfat1的gene id:4773,也可以为nm_012340.5、nm_173091.4、nm_001136021.3、nm_001258294.2;包括不限于上述登录号。
3、本发明所述的c-met的gene id:4233,也可以为nm_001127500.3、nm_001324401.3、nm_001324402.2;包括不限于上述登录号。
4、本发明提供了一种nfat1抑制剂在制备治疗细胞迁移水平升高型胰腺癌或肺纤维化的药物中的应用,所述药物为降低胰腺癌及肺上皮中nfat1基因表达水平。
5、在本发明的一种实施方式中,所述药物中含有上述nfat1抑制剂以及药学上可接受的辅料。在本发明的一种实施方式中,所述抑制剂包括核酸抑制剂、或蛋白抑制剂。
6、在本发明的一种实施方式中,所述核酸抑制剂包括sirna、shrna、核酶、反义寡核苷酸。
7、在本发明的一种实施方式中,所述蛋白抑制剂包括中和nfat1的抗体。
8、在本发明的一种实施方式中,所述nfat1抑制剂包括所述干扰rna序列和载体,载体为病毒载体或非病毒载体。
9、在本发明的一种实施方式中,所述病毒载体包括慢病毒、假病毒、腺病毒、腺相关病毒、泡沫病毒、单纯疱疹病毒,抗逆转录病毒、巨细胞病毒载体;所述非病毒载体包括能与质粒dna或基因编辑片段形成复合物并促进细胞内基因转移的人工合成或天然化合物;所述载体材料为如脂类、聚合物、蛋白质和多肽,能够采用外泌体运载所述干扰rna序列或含有干扰rna序列的重组基因片段;所述的抑制nfat1基因的试剂包括nfat1基因的shrna、nfat1基因的sirna、抑制nfat1基因表达的小分子化合物以及nfat1的单抗。其中正义链的3’末端tt为两个垂挂碱基。
10、本发明还提供了一种筛选药物的方法,所述药物为c-met抑制剂,所述方法包括,
11、测试组中,在培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组中nfat1的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中nfat1的表达量和/或活性;
12、其中,如果测试组中nfat1的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是c-met抑制剂。
13、在本发明的一种实施方式中,测试组中,是将测试化合物与cfpac-1胰腺癌细胞共同孵育后,检测nfat1的表达量和/或活性。
14、本发明还提供了一种筛选c-met抑制剂的细胞模型的构建方法,所述方法为:所述方法为:测试组中,在培养体系中添加测试化合物,将测试化合物与cfpac-1胰腺癌细胞共同孵育后,并观察所述测试组中nfat1的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中nfat1的表达量和/或活性;
15、其中,如果测试组中nfat1的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是c-met抑制剂。
16、本发明还提供了一种减弱肺上皮细胞的迁移的药物的筛选方法,所述方法为,
17、测试组中,在培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性;
18、其中,如果测试组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是减弱肺上皮细胞的迁移的药物,所述药物用于治疗肺纤维化。
19、本发明还提供了一种筛选减弱肺上皮细胞的迁移的细胞模型的构建方法,所述方法为:测试组中,在培养体系中添加测试化合物,将待测化合物和beas-2b细胞共同孵育后,并观察所述测试组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性;
20、其中,如果测试组中nfat1和/或c-met的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是减弱肺上皮细胞的迁移的药物,所述药物用于治疗肺纤维化。
21、本发明还提供了一种nfat1基因在制备用于诊断或治疗细胞迁移水平升高型胰腺癌及肺纤维化的试剂盒中的应用。nfat1基因的表达水平与细胞迁移相关蛋白c-met呈正相关。
22、在本发明的一种实施方式中,所述细胞迁移水平升高型胰腺癌表现为胰腺癌及肺上皮组织中c-met表达水平升高,胰腺癌及肺上皮细胞迁移能力升高。所述细胞迁移水平升高型胰腺癌的治疗试剂为降低胰腺癌及肺上皮中nfat1基因表达水平的试剂。
23、在本发明的一种实施方式中,所述治疗试剂为nfat1抑制剂vivit。
24、在本发明的一种实施方式中,所述nfat1抑制剂可以降低nfat1表达进而降低c-met基因表达,同时降低胰腺癌细胞和肺上皮细胞的迁移能力。
25、在本发明的一种实施方式中,所述nfat1抑制剂在胰腺癌细胞cfpac-1和patu-8988的浓度分别为10um和100nm,在肺上皮细胞的浓度为100nm,用于降低nfat1基因表达。
26、在本发明的一种实施方式中,所述干扰rna序列采用的包括针注射、基因枪、电穿孔、超声波处理和流体动力学的形式进行基因传递。
27、在本发明的一种实施方式中,所述试剂盒在胰腺癌及肺纤维化疾病中抑制细胞迁移发挥其临床及实际应用。
28、本发明提供一种降低c-met基因表达的方法,所述方法通过使用nfat1抑制剂抑制nfat1基因表达,进而降低c-met的基因表达水平。
29、在本发明的一种实施方式中,所述方法可以通过细胞培养加入nfat1抑制剂后通过培养,提取rna,进行cdna反转,进行qpcr在转录水平进行验证nfat1表达下降的同时c-met表达下降;
30、在本发明的一种实施方式中,所述方法可以通过细胞培养中加入nfat1抑制剂通过培养,收蛋白,测bca浓度,测wb在蛋白水平验证nfat1表达降低后c-met表达下降;
31、本发明提供一种抑制胰腺癌和肺上皮细胞迁移的方法,所述方法可以通过加入nfat1抑制剂,降低nfat1的表达,进而降低c-met表达,从而导致细胞迁移率下降。
32、在本发明的一种实施方式中,所述方法可以通过transwell侵袭小室实验,通过在24孔板每孔铺板4x104个细胞,在小室上层加入1%fbs的培养基,小室下层加入10%fbs的培养基,通过72h的细胞培养进行固定、染色,在显微镜下拍照通过数细胞数验证加入抑制剂后细胞的迁移能力下降;
33、在本发明的一种实施方式中,所述胰腺癌细胞培养基为rpmi培养基,所述肺上皮细胞培养基为dmem培养基。
34、本发明还提供了一种用于检测nfat1、c-met的qrt-pcr引物,包括上游引物和下游引物,序列为:
35、nfat1上游引物,gatagtgggcaacaccaaagtcc;
36、nfat1下游引物,tctcgcctttccgcagctcaat;
37、c-met上游引物,ccacgggacaacacaataca;
38、c-met下游引物,taaagtgccaccagccatag。
39、本发明提供一种筛选药物的方法,所述药物为nfat1抑制剂,所述方法包括,
40、测试组中,在培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组中c-met的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中c-met的表达量和/或活性;
41、其中,如果测试组中c-met的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是nfat1抑制剂。
42、在本发明的一种实施方式中,测试组中,是将测试化合物与cfpac-1胰腺癌细胞共同孵育后,检测c-met的表达量和/或活性。
43、本发明还提供了一种筛选nfat1抑制剂的细胞模型的构建方法,所述方法为:测试组中,在培养体系中添加测试化合物,将测试化合物与cfpac-1胰腺癌细胞共同孵育后,并观察所述测试组中c-met的表达量和/或活性;在对照组中,在相同的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组中c-met的表达量和/或活性;
44、其中,如果测试组中c-met的表达量和/或活性低于对照组,就表明该测试化合物是nfat1抑制剂。
45、有益效果
46、相对于现有技术,本发明具有以下优势
47、(1)相较于手术治疗及化疗等传统方法,本发明揭示并验证一种新的胰腺癌诊断和治疗靶点,从增殖与侵袭迁移的分子机制入手,为胰腺癌治疗提供新思路;
48、(2)本发明揭示胰腺癌在基因表达水平上的变化,针对胰腺癌难以早期发现和诊断提供新方法;
49、(3)本发明通过加入nfat1抑制剂,降低nfat1基因表达,从而降低c-met基因表达,最终降低胰腺癌细胞和肺上皮细胞的迁移能力;
50、(4)本发明突破传统的治疗思路,从肺上皮细胞分子表达的水平和划痕以及迁移机制入手,为肺纤维化的诊断和治疗提供新思路和新方法。
技术研发人员:秦奎瑛,孙依鹏,徐菡苗,蒋唯依,肖婕妤,徐晓宇,周晴,陈琛
技术所有人:江南大学
备 注:该技术已申请专利,仅供学习研究,如用于商业用途,请联系技术所有人。
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