一种肺炎球菌多糖-VZV重组蛋白结合疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种用于预防肺炎球菌感染及vzv感染的肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、肺炎球菌（streptococcus pneumoniae）是一种革兰氏阳性菌，细菌外膜由一层荚膜多糖包裹，荚膜是其主要的致病因素，依据不同荚膜多糖化学结构的不同，并以特异性抗血清进行分类，现已发现有91种不同血清型肺炎球菌。肺炎球菌所引起的肺炎球菌性疾病（pneumococcal disease）是一种全球性的公共卫生难题，对人类健康构成严重威胁。根据肺炎球菌感染部位，可分为包括脑膜炎、菌血症和菌血症肺炎等在内的侵袭性疾病以及急性中耳炎、鼻窦炎和非菌血症性肺炎等在内的非侵袭性疾病。肺炎球菌通常定植于鼻咽部，一般不引起临床症状，然而当定植的环境发生变化，如人体免疫力下降、遭受其他呼吸道病毒感染、营养不良或年老体弱等情况下，肺炎球菌便可能突破黏膜防御，极易引发侵袭性感染。

2、全球肺炎球菌性疾病负担日趋严重，据统计，2019年全球33种细菌感染导致770万人死亡，其中肺炎球菌排第3位，肺炎球菌感染导致82.9万人死亡，如换算成寿命损失年，肺炎球菌则排在第1位，并且因感染肺炎球菌所致死亡病例主要分布在5岁以下儿童和60岁以上的老年人中。对于婴幼儿，尤其是2岁以下的儿童，他们极易感染肺炎球菌，且病死率极高，大约75%的侵袭性肺炎球菌性疾病和83%的肺炎球菌脑膜炎发生在这一年龄段（见who立场文件2019版）。同样地，对于老年人，其感染侵袭性肺炎球菌导致疾病的发病率和死亡率也不容小觑。据报道，在中国，肺炎是老年人死亡的第四大原因，每年有约12.5万人死亡，肺炎感染率因地区而异，从28.0%到71.5%不等，而且随着年龄的增长，老年人肺炎的发病率也急剧上升。与此同时，在当今全球人口老龄化趋势日益加剧的时代，联合国发布的《2023年世界社会报告》指出，2021年全球65岁及以上人口为7.61亿，到2050年这一数字将增加到16亿，80岁及以上的人口增长速度更快。由此可见，老年人作为肺炎球菌感染的高危人群，人口老龄化的加剧势必也会导致肺炎球菌性疾病负担的日益加重。

3、肺炎球菌疫苗是预防肺炎球菌感染的最有效手段，目前已上市的疫苗为肺炎球菌多糖疫苗（pneumococcal polysaccharide vaccine，ppv）和肺炎球菌结合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，pcv）。上世纪80年代，惠氏公司（2009年被辉瑞收购）生产的23价肺炎球菌多糖疫苗（ppv23）在全球范围内对优势血清型的免疫覆盖率达到了90%左右，但仍存在局限性，研究发现细菌多糖为非t细胞依赖性抗原，在儿童及成人中能够诱导短期免疫效应，但对婴幼儿无效，尤其是在2岁以下儿童中无法诱导有效的免疫应答。经过开发，将多糖与载体蛋白共价键结合，可将非t细胞依赖性抗原转变为t细胞依赖性抗原，采用该技术制备的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗（pcv）可在婴儿2月龄时开始接种，可促进较强的免疫反应和记忆反应，是能够更快、更早地预防肺炎球菌的有利免疫方法。全球首个于2000年获得fda上市批准的pcv是惠氏公司生产的pcv7（prevnar 7）。2010年，辉瑞公司上市能覆盖更多型别的pcv13（prevnar 13），取代了pcv7（prevnar 7）用于儿童常规疫苗接种。目前已通过who预认证的pcv有3个，gsk公司pcv10（synflorix），辉瑞公司pcv13（prevenar 13）以及印度血清所pcv10（pneumosil）。2021年fda先后又批准了更高价次的pcv上市，包括辉瑞公司pcv20（prevnar 20）和默沙东公司pcv15（vaxneuvance）。国内上市的肺炎球菌多糖结合疫苗为沃森生物的pcv13和民海生物的pcv13。研究发现，结合疫苗可用于任何年龄段人群，接种效果也较多糖疫苗更长效持久，因此，多糖蛋白结合疫苗将成为肺炎球菌疫苗的主要发展趋势。

4、随着肺炎结合疫苗在国内外的使用，不同地区流行的血清型也发生了明显变化，一些非疫苗覆盖血清型的发病率上升明显，国际上更高价次的肺炎球菌结合疫苗的开发也在紧锣密鼓地进行。但是，这些结合疫苗有一个共同缺点，就是载体蛋白没有被赋予免疫原性的保护功能；也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但是疫苗设计者并没有能够利用载体蛋白产生的抗体来预防疾病。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒变异株毒素等广泛被用作载体蛋白的主要原因，并不是因为它们产生的抗体具有保护性，而是从其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。另外，破伤风类毒素和白喉类毒素已经是百白破三联疫苗中的二个组分，已用于常规接种，所以肺炎结合疫苗中的载体蛋白是否能刺激机体产生保护性抗体并不重要。由此可见，在提高肺炎球菌疫苗价次，扩大覆盖范围的同时，载体蛋白的选择也是十分重要的考虑因素。

5、水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus，vzv）属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是八种人类疱疹病毒之一，也叫做3型人疱疹病毒。vzv病毒由核衣壳包裹一个线性、双链dna构成，有一个蛋白层将核衣壳与酯包被 （lipid envelope）分离，这个蛋白层组成了主要的病毒糖蛋白。vzv生产约六种糖蛋白，现标明为gb、gc、ge、gh、gi和gl，这些蛋白在病毒繁殖时，也表达在被感染的细胞膜表面。但是在被感染的细胞中，ge蛋白是产生最多的蛋白，它以非共价键形式与gi吸附，可与抗体g（igg）的 fc片段吸附，是十分重要的抗原蛋白。

6、vzv病毒遍布全球，具有很强的传染性，迄今只发现一种血清型，在自然界只感染人类。vzv引起的原发感染表现为水痘，常见于儿童期，在原发感染后，病毒可在宿主感觉神经元内潜伏。除此之外，研究发现fda批准的用于水痘预防的oka株减毒活疫苗和野生型病毒一样也会建立潜伏感染。随着年龄增长、免疫功能受损等会导致细胞免疫应答削弱，这会诱导vzv再激活并引发带状疱疹（herpes zoster，hz），带状疱疹多见于成年人和老年人。其症状表现为单侧性水泡样皮疹，通常会出现发烧乏力等症状，局部皮肤开始发红并伴随有灼热感和神经疼痛感。在带状疱疹患者中约9％～34％的患者会发生带状疱疹后神经痛（post-herpetic neuralgia，phn），疼痛评级可达7级以上，属于重度疼痛，严重影响患者生活质量。

7、随着全球人口老龄化趋势日益加重，带状疱疹的发病率及负担也呈显著上升的趋势。其中，亚太地区带状疱疹发病率约为1％，发病率随着年龄增长而升高，50岁之后带状疱疹发病率达5％以上。且随着每年vzv感染进一步持续增长，预计感染发病率增幅在35％-100％不等。据统计，截至2023年底，我国60岁及以上的人口数量达到了近3亿，占全国总人口的21.1%，其中65岁及以上的人口占比为15.4%。我国每年带状疱疹患者数量为277万，其中50岁及以上人群每年新发带状疱疹病例超过150万，疾病花费约13亿元。2010年中国50岁以上人群带状疱疹患者约900万，经济负担超过77亿元。然而，目前治疗带状疱疹和带状疱疹后神经痛尚无特效药，临床大多使用阿昔洛韦等广谱的抗病毒药物进行治疗，也有使用一些麻醉或非麻醉的镇痛药以及抗惊厥、抗抑郁的药物来缓解带状疱疹带来的剧烈神经痛，并且带状疱疹即使痊愈仍然可能复发，因此接种vzv疫苗是预防带状疱疹的有效手段。

8、目前，fda已上市的vzv的疫苗有两款，分别是美国默克（merck）的zostavax和葛兰素史克（gsk）的shingrix。其中zostavax以oka株为主的减毒活疫苗，在60～69岁的人群中，以单次皮下注射的方式使用zostavax，疫苗的预防效力达到64％。但随着年龄的增长，zostavax疗效下降，在60岁以上的成年人中，疫苗对phn的有效率仅为39％。另一款疫苗是gsk的重组蛋白亚单位疫苗，shingrix包含了ge糖蛋白以及as01b佐剂，ge是vzv最丰富的糖蛋白，含有潜在的中和作用表位和t细胞表位，对于病毒繁殖和在神经节细胞间传导具有关键性作用。该疫苗通过肌肉注射的方式免疫，显示在60～69岁个体中预防hz的疫苗效力为97 .4％，在所有测试年龄组中均>90％，包括≥80岁的个体，效果优于默克（merck）的减毒活疫苗zostavax。虽然shingrix重组蛋白疫苗效果明显优于减毒活疫苗zostavax，但该疫苗配方复杂，aso1b佐剂系统，特别是其中的qs-21不能化学合成，原材料较稀缺，生产成本较高，价格昂贵。因此，国内自主开发一款预防vzv感染的重组蛋白疫苗也是十分必要的。

9、疫苗领域产品的特点是一种疫苗可预防特异性病原体的感染，比如，肺炎球菌多糖结合疫苗可预防由肺炎球菌感染引起的肺炎、脑膜炎及中耳炎，带状疱疹病毒重组蛋白疫苗可预防带状疱疹病毒复活导致的带状疱疹。为了达到一个制剂可预防多种病原体感染，目前采用的手段是联合疫苗，如儿童用白喉、百日咳、破伤风三联，儿童用白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎和流感嗜血杆菌五联，儿童用白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎、流感嗜血杆菌及乙型肝炎六联等，这些疫苗都是由单一产品疫苗混合制备，到目前临床评估来看，部分联合苗中的单苗的预防效果不佳。

10、此外，当前适龄儿童需要接种至少15种疫苗，接种次数是疫苗种类的数倍；同时，由于人群的老龄化，仅中国老年人口已达三亿多，保护老年人的健康，开发针对于老年人的疫苗产品也是不可忽视的。因此，开发多联多价结合疫苗取代单品种疫苗以及实现疫苗保护人群的全覆盖，必然是未来疫苗领域研发的首要任务。并且随着疫苗价次的提高，多糖蛋白结合疫苗中的载体蛋白如何选择，以避免载体抑制效应，又如何设计获得稳定且高表达的载体蛋白，同时将具有免疫原性的载体蛋白与其他免疫原性物质结合（如肺炎球菌荚膜多糖），制备出具有双重免疫原性的疫苗，达到一种疫苗可同时有效预防两种疾病的效果，也成为多糖重组蛋白结合疫苗开发面临的重要挑战。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的不足，本发明利用多糖-蛋白结合疫苗技术，将经氨基酸突变修饰获得稳定性增强的ge蛋白作为载体蛋白，制备一种新型的肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗。该疫苗具有双重免疫原性，一种疫苗可同时有效预防肺炎球菌感染和vzv感染引起的疾病，进一步提高疫苗的保护范围和免疫效果。本发明的优势在于它可以提供更高效、更安全、更广泛、更稳定的保护作用，有望成为预防肺炎球菌和vzv感染的有效手段。

2、本发明解决技术问题的技术方案如下：

3、在本发明的第一方面，提供了一种肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，所述结合疫苗中的载体蛋白为具有免疫原性的vzv重组蛋白；所述的肺炎球菌多糖以共价键与vzv重组蛋白相连接；所述vzv重组蛋白选自ge糖蛋白，其氨基酸序列如seq id no：3或seq idno：4所示。

4、优选地，所述结合疫苗中，所述肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f及33f中的一种或多种。在本发明的一种优选实施方式中，所述结合疫苗为24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，其中vzv重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述的肺炎球菌多糖包括24种血清型，即血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f及33f。在本发明的另外一种优选实施方式中，所述结合疫苗为24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，其中vzv重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：4所示，所述的肺炎球菌多糖包括24种血清型，即血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f及33f。

5、优选地，所述的结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。

6、优选地，所述的结合疫苗中含有佐剂。更优选地，所述的佐剂为cpg、qs21、磷酸铝、cpg与磷酸铝混合物、或qs21与磷酸铝混合物中的任意一种。

7、在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：使肺炎球菌多糖和vzv重组蛋白在缓冲液或有机溶剂中发生化学合成反应，通过反应将肺炎球菌多糖共价结合在vzv重组蛋白上，得到结合物。

8、优选地，所述的制备方法还包括肺炎球菌多糖的前处理、vzv重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。更优选地，所述的多糖的前处理，包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法或酶消化法。

9、优选地，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

10、优选地，所述的化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate法、己二酰二肼法或1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的任意一种。

11、本发明具有如下技术效果：

12、（1）本发明通过对载体蛋白即vzv ge蛋白进行氨基酸突变修饰，可使得载体蛋白在不同温度环境下仍然保持其结构稳定性及抗原簇功能。即使经历化学反应后，仍然能够保持ge载体蛋白的抗原性。

13、（2）本发明还提供了24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，其是一种创新型疫苗，可用一种疫苗产品来同时预防两种常见疾病，即肺炎及带状疱疹，大大减少了疫苗接种次数，降低了免疫接种成本，并提高了免疫覆盖率。

14、（3）本发明还提供了24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗的制备方法，vzv重组蛋白是以基因重组技术生产的氨基酸部分序列或全序列，对氨基酸进行突变修饰后稳定性增强的ge蛋白载体在与新型佐剂制剂，并免疫动物后，结合物多糖抗原部分可刺激机体产生特异性血清型多糖抗体，载体蛋白部分可刺激机体产生针对于vzv病毒的体液免疫（保护性抗体）和细胞免疫，达到一种24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗免疫后，可同时预防24种肺炎球菌及带状疱疹的感染。

15、（4）本发明制备的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗具有协同增效的技术效果：一方面，从实施例11可以看出，相较于辉瑞pcv20以crm197为载体蛋白的结合疫苗，本发明制备的结合疫苗以经氨基酸突变修饰的vzv重组蛋白作为载体蛋白，对多糖的抗原性增强效果更好。其中，免疫第二针后，本发明的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗（制剂c）和pcv20辉瑞（制剂d）刺激动物产生相应血清型多糖抗体igg滴度根据血清型不同有所差异，血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、10a、11a、14、15b、18c、19a、23f及33f结果显示制剂c要明显高于制剂d，占85％组分；血清型12f、19f及22f制剂d稍高于制剂c，只占15％组分。另一方面，从实施例13可以看出，本发明制备的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗其免疫抗血清中抗ge蛋白的总igg、igg1、及igg2a的抗体滴度，相较于ge重组蛋白免疫制剂的抗体滴度没有显著差别，两者都能达到较好的免疫效果。与此同时，从实施例14也可以看出，本发明制备的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗具备刺激动物体的脾脏中的免疫细胞，如nk细胞，吞噬细胞等，生产ifn-γ，并且24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，在ge抗原或vzv病毒刺激下，被致敏免疫细胞产生ifn-γ明显高于ge蛋白制剂，说明本发明制备的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的能力更强。

16、（5）本发明制备的24价肺炎球菌多糖-vzv重组蛋白结合疫苗，在覆盖更多价次的肺炎球菌血清型，扩大疫苗保护范围的同时，也能够达到更好的免疫效果。从实施例11可以看出，相比于pcv20（肺炎球菌20价结合疫苗），本发明结合疫苗中新增的4种血清型pn2、pn9n、pn17f、pn20抗血清igg抗体滴度gm检测值分别为320.8、577.7、334.2、521.1，要显著高于pcv20的20种多糖igg抗体滴度的平均值。