一种递送遗传物质的多肽-脂质纳米复合物、制备和用途的制作方法

本发明涉及药物递送领域，具体涉及一种递送遗传物质的多肽-脂质纳米复合物、制备和用途。

背景技术：

1、基因转染是一种将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术。基因载体是指将外源的治疗性基因导入生物细胞内的一种工具。虽然大多数细胞可以自发地摄取核酸，但是效率很低并且在低剂量就饱和了。此外由于自然界存在大量的rna酶(rnase)，使得rna在体内外均非常不稳定，容易被降解。因此，需要合适的制剂来保护核酸免受细胞外rnase介导的降解并促进其进入细胞。

2、细胞内遗传物质的递送系统可分为三大类，即涉及直接注射裸露的dna或rna的系统，利用病毒或经基因修饰的病毒的系统以及利用非病毒递送剂的系统。每种都有其优点和缺点。尽管病毒作为递送剂具有高效和高细胞选择性的优点，但它们具有毒性、发生炎症反应和难以处理大dna片段的缺点。

3、非病毒基因递送系统基于通过dna或rna的带负电的磷酸骨架与阳离子脂质、肽或其他聚合物之间的静电相互作用将遗传物质压制成纳米颗粒。相对于病毒，使用包含脂质的非病毒转染载体可以引起更低的毒性，尤其是更低的免疫原性；合理有效的靶向以及增强的包装能力，例如处理核酸物质大片段的能力。不幸的是，特别是对于mrna，目前的递送效果仍存在更加高效的递送需求，且根据一些已见临床信息的脂质体递送系统，已经注意一些由脂质本身带来的毒性和免疫反应。

技术实现思路

1、多肽作为线性结构的分子，可以通过化学改造或生物表达的形式形成环、订书等分子内自交联结构，环化后的多肽可以有效延长其本身的半衰期并增强其结构稳定性，其次，环化后提供的疏水结构可以有效增强细胞对环肽的摄取，最后，肽经过环化后能有效提升其从内涵体中逃逸的能力，进而改良遗传物质的释放，多肽相比与脂质具有更高效、更安全、更具有耐受性，同时也具有更高选择性、不易在体内蓄积的优点。

2、基于上述特点，设计了一种环状多肽与脂质组合的新型递送载体配方，通过两种组分的协同作用，减少了脂质组分的用量，采用多肽承担部分递送功能。该载体不一定需要具有整体正电荷，因此可以减少不良的血清相互作用。环肽成分提供核酸包装功能，可保护dna或rna不受细胞内或细胞外降解、内体或其他方式的影响。脂质成分通过膜融合或透化作用介导与内体脂质双层的相互作用，减少内体或溶酶体降解，并允许核酸转运到细胞质中。同时，环肽成分还可以设计成细胞类型特异性或细胞表面受体特异性，从而改善目前脂质体强烈的肝脏脱靶效应。

3、为解决上述问题，本发明提供一种用于将核酸非病毒方式地递送至细胞的多肽-脂质纳米复合物的组合形式(成分种类)。该多肽-脂质纳米复合物可以任选地包含基于总脂质的量按摩尔浓度为20％至100％的结构脂质以及其他脂质组分从而对核酸形成有效的保护。(成分比例)第三方面，本发明提供了一种可以在体外将sirna、mrna有效递送入细胞的转染复合物(体外应用)。第四方面，本发明提供了一种可以在体内将sirna、mrna递送至肌肉、肝脏以及肝外器官或组织的递送载体(体内应用)。

4、在第一方面，本发明提供一种递送遗传物质的多肽-脂质纳米复合物，包括：

5、(1)核酸；

6、(2)多肽，多肽占所述复合物中的质量百分比为5％-75％，多肽为单一多肽或至少两种多肽的组合物；

7、(3)脂质组分，脂质组分包括：

8、a、结构脂质，结构脂质占所述复合物中的比例约为5mol％-80mol％，

9、b、穿膜脂质，穿膜脂质占所述复合物中的比例约为0mol％-50mol％，

10、c、缀合脂质，缀合脂质占所述复合物中的比例约为0mol％-3mol％。

11、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，多肽占所述颗粒中的质量百分比为12％-50％。

12、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，所述多肽的长度包含2-100个氨基酸，多肽中的氨基酸序列来源于天然多肽或人工设计的多肽。

13、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，所述多肽含有一定比例的极性氨基酸，极性氨基酸占多肽的质量比范围为10％-80％；优选的，极性氨基酸占多肽的质量比范围为30％-65％。

14、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，极性氨基酸包括带正电的氨基酸，其中带正电的氨基酸占极性氨基酸的质量比范围为0％-100％。进一步优选的，带正电的氨基酸占极性氨基酸的质量比范围为25％-100％。

15、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，氨基酸序列来源于天然多肽，其结构可以是未环化或通过引入可切割的化学键交联成环的形式，交联成环的位点可以是整段多肽的环化或对某一部分区域进行环化。

16、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，氨基酸序列来自于细胞穿透肽、抗菌肽、内涵体逃逸肽、粘附肽、靶向肽、天然环肽和蛋白中的一种或多种。

17、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，细胞穿透肽的序列包括但不限于基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽或vepep肽中的一种或多种。优选的，vepep肽包括vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽或vepep-9肽等等。

18、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，细胞穿透肽还包括组蛋白。组蛋白包括但不限于h2a或h4等等。

19、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，抗菌肽序列包括但不限于抗菌衍生的阳离子肽。优选的，抗菌肽序列但不限于丁福林-2、magaininii、cecropin、andropin、moricin、ceratototoxin、melittin、bombinin、brevinin-1、esculentins、cap18、ll37、bac715-24/bac715-24、bac1-7、bac1-15、bac1-17、bac1-24、bac5-24、bac7-24、bac9-24、bac11-24、bac13-24、bac15-24、synb1、synb3、synb5、dermaseptin s4、abaecin、apidaecin、prophenin和吲哚杀虫素中的一种或多种。

20、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，内涵体逃逸肽序列包括但不限于hct衍生肽。例如hct衍生肽为hct9-32、hct12-32、hct15-32、hct18-32或hct21-32等等。

21、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，靶向肽包括但不限于rgd、rgd肽、转铁蛋白受体肽、叶酸、信号肽或信号序列、定位信号或序列、核定位信号或序列(nls)、受体的配体、合成配体和rgd肽模拟物类似物中的一种或多种；或

22、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，天然环肽包括但不限于环孢菌素a(cyclosporin-a)、短杆菌肽s(gramicidin-s)、万古霉素(vancomycin)和达托霉素(daptomycin)、aplidine及茜草科类型环肽(ra-v,6和ra-viii)和菊科类型环肽(astin-c)中的一种或多种；或

23、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，蛋白包括但不限于鱼精蛋白、乳铁蛋白、组蛋白、转铁蛋白和亲合体小蛋白中的一种或多种。

24、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，多肽中的氨基酸序列来源于人工设计的多肽，多肽为人工设计的重复或非重复的氨基酸序列的未环化多肽。优选的为hl系列肽。

25、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，多肽中的氨基酸包括带正电的氨基酸，带正电的氨基酸可选自k(赖氨酸)、r(精氨酸)、h(组氨酸)和o(鸟氨酸)中的一种或多种；带正电的氨基酸的构型包括天然的l-构型以或非天然的d-构型。

26、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，多肽中氨基酸序列的结构包含线性结构、分支结构或按照不同功能域进行组合，多肽的空间结构可以是未修饰或分子内通过可被切割的键交联成环而形成环状多肽。

27、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，环状多肽包含至少一个或多个环状结构，其环合方式包括可以切割的化学键或相对稳定的化学键，参与成环的氨基酸比例为整体序列的30％-100％。

28、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，环状多肽成环区域的构建可包含完全极性氨基酸构成，或极性、非极性氨基酸交替排布构成，完全非极性氨基酸构成，或整体形成环状结构。

29、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，脂质组分可以是结构脂质、穿膜脂质、缀合脂质以某一种脂质单一使用或按照一定的比例进行复配。

30、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，结构脂质是用于起结构填充作用的脂质，结构脂质占所述纳米复合物的质量百分比为5％-70％。

31、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，结构脂质包括但不限于胆固醇及其他甾体衍生物或磷脂。

32、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，胆固醇及其衍生物包括但不限于胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和皮质类固醇中的一种或多种。

33、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

34、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，穿膜脂质具有与带负电生物分子组装的特性，穿膜脂质可以与货物或多肽分子通过静电作用力结合，形成一定尺寸的纳米结构，同时，穿膜脂质本身自带或通过环境响应带电的特性在包内递送的过程中可以起促进内涵体逃逸的功能。

35、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，穿膜脂质包括但不限于阳离子脂质、hlv系列脂质、可离子化脂质及含有无机抗衡离子对的穿膜脂质；其中，hlv系列脂质为专利号为202310038713.6的专利中的物质。

36、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，阳离子脂质包括dtdtma(双十四烷基三甲基铵)、dotma(2,3-二油基氧基丙基-1-三甲基铵)或dhdtma(双十六烷基三甲基铵)等等。

37、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，可离子化脂质包括但不限于dlin-mc3-dma(4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯)、sm-102(8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯)、alc-0315((4羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷6,1二基)双(2己基癸酸酯)等等。

38、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，含有无机抗衡离子对的穿膜脂质优选为无机抗衡离子，尤其是药学上可接受的阴离子。例如氯离子或溴离子等。

39、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，穿膜脂质占所述复合物的质量百分比范围为5％-65％。

40、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，缀合脂质用于防止颗粒聚集的脂质，缀合脂质包括但不限于聚乙二醇(peg)、聚肌氨酸、聚乳酸、聚羧基甜菜碱或多肽的脂质缀合物等等。

41、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，peg-缀合脂质包括但不限于peg-二酰甘油(peg-dag)、peg-二烷氧基丙基(peg-daa)缀合物或其混合物等等。

42、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，peg-缀合脂质中所述的peg的平均分子量为约2000道尔顿。

43、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，peg-缀合脂质占所述复合物的质量百分比范围为0.5％-3％。

44、作为本专利所述多肽-脂质纳米复合物的一种优选方案，脂质组份包括结构脂质、穿膜脂质、缀合脂质的任意一种或几种的组合。

45、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

46、(1)核酸；

47、(2)多肽，多肽占所述占所述复合物中的质量百分比约为7％-54％；

48、(3)结构脂质，结构脂质为胆固醇或其衍生物，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为46％-93％。

49、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

50、(1)核酸；

51、(2)多肽，多肽占所述占所述复合物中的质量百分比约为12％-69％；

52、(3)结构脂质，结构脂质为磷脂，磷脂占所述复合物中的质量百分比约为31％-88％。

53、本发明提供多肽-脂质纳米复合物，包含：

54、(1)核酸；

55、(2)多肽，多肽占所述占所述复合物中的质量百分比约为10％-87％；

56、(3)结构脂质包括磷脂、胆固醇或其衍生物，其中，磷脂占所述复合物中的质量百分比约为13％-70％，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为36％-90％。

57、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

58、(1)核酸；

59、(2)多肽，多肽占所述占所述复合物中的质量百分比约为40％-84％；

60、(3)穿膜脂质为阳离子脂质，阳离子脂质占所述复合物中的质量百分比约3％-21％；

61、(4)结构脂质为胆固醇或其衍生物，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为6％-39％。

62、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

63、(1)核酸；

64、(2)多肽，多肽占所述复合物中的质量百分比约为26％-74％；

65、(3)穿膜脂质为阳离子脂质，阳离子脂质占所述复合物中的质量百分比约为13％-49.3％；

66、(4)结构脂质为胆固醇或其衍生物，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为8.6％-38.6％。

67、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

68、(1)核酸；

69、(2)多肽，多肽占所述占所述复合物中的质量百分比约为44％-86％；

70、(3)穿膜脂质为阳离子脂质，阳离子脂质占所述复合物中的质量百分比约6％-24％；

71、(4)结构脂质包括磷脂、胆固醇或其衍生物，其中，磷脂占所述复合物中的质量百分比约为3％-11％，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为4％-21％。

72、本发明提供一种多肽-脂质纳米复合物，包含：

73、(1)核酸；

74、(2)多肽，多肽占所述复合物中的质量百分比约为7％-66％；

75、(3)穿膜脂质为阳离子脂质，阳离子脂质占所述复合物中的质量百分比约为17％-46％；

76、(4)结构脂质包括磷脂、胆固醇或其衍生物，其中，磷脂占所述复合物中的质量百分比约为3％-27％，胆固醇或其衍生物占所述复合物中的质量百分比约为13％-36％；

77、(5)缀合脂质，缀合脂质占所述复合物中的质量百分比约为1％-3％。

78、本发明的多肽-脂质纳米复合物，使细胞与其相接触。

79、作为一种优选方案，所述细胞是哺乳动物的细胞。

80、本发明的多肽-脂质纳米复合物对哺乳动物受试者施用。

81、作为一种优选方案，其中所述哺乳动物受试者选自由以下各项组成的组：口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、病灶内、气管内、皮下或皮内。

82、在第二方面，本发明还提供一种用于将核酸非病毒递送至细胞的多肽-脂质纳米复合物，其包含如本发明的第一方面所定义的多肽和脂质组分，脂质组分包括结构脂质、穿膜脂质以及缀合脂质。本发明第一方面的多肽-脂质纳米复合物可以任选地包含基于脂质组份的总量按摩尔浓度为20％至80％的结构脂质，可以对核酸进行有效的保护。

83、在第三方面，本发明提供了一种可以在体外将核酸有效递送入细胞的转染复合物，其包含本发明的第一方面或第二方面的多肽-脂质纳米复合物和核酸。该核酸有利地是rna，尤其是mrna。

84、在第四方面，本发明提供了一种可以在体内将sirna、mrna递送至肌肉、肝脏以及肝外器官或组织的递送载体。

85、本发明所提供的技术方案至少有以下一种或几种有益效果：

86、环状多肽与脂质组合的新型递送载体配方，通过两种组分的协同作用，减少了脂质组分的用量，采用多肽承担部分递送功能。该载体不一定需要具有整体正电荷，因此可以减少不良的血清相互作用。

87、多肽成分提供核酸包装功能，可保护dna或rna不受细胞内或细胞外降解、内体或其他方式的影响。

88、脂质成分通过膜融合或透化作用介导与内体脂质双层的相互作用，减少内体或溶酶体降解，并允许核酸转运到细胞质中。

89、同时，环肽成分还可以设计成细胞类型特异性或细胞表面受体特异性，从而改善目前脂质体强烈的肝脏脱靶效应。