一种促进细胞生长因子表达、血管新生的金樱子提取物的制备方法及应用与流程

本发明属于中药技术，特别涉及一种促进细胞生长因子表达、血管新生的金樱子提取物的制备方法及应用。

背景技术：

1、细胞生长因子是一类由多种细胞分泌并作用于特定的靶细胞，通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞分裂、基质合成与组织分化等功能的活性蛋白质或多肽类物质。细胞生长因子有多种类别，主要可分为血小板类生长因子[血小板源性生长因子（pdgf）、骨肉瘤来源生长因子（odgf）]、表皮类生长因子[表皮生长因子（egf）、转化生长因子（tgf-α和tgf-β）]、成纤维细胞生长因子（afgf和bfgf）、类胰岛素生长因子（igf-i和igf-ii）、神经生长因子（ngf）、白细胞介素类生长因子（il-l、il-l、il-3等）、红细胞生长素（epo）等。大量研究已证实，细胞生长因子具有促进细胞生长、分化、增殖和迁移，调控新陈代谢等重要功能，对免疫功能调节、造血系统调控、肿瘤发生与发展、炎症与感染、伤口修复、组织重建等方面产生重要的调控作用，具有广泛的应用前景和潜力。目前发现的大部分促细胞生长因子已能被人工合成或者人工介导表达，但成本较高导致售价昂贵，同时用法和用量不当还会产生一定的副作用。目前已有研究证实中药能促进细胞生长因子的分泌。

2、血管新生一般指组织中既存毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新血管的过程，在多种生理、病理条件下都会出现，如生长发育、伤口愈合、缺血性心血管疾病治疗（如冠心病）等。血管新生过程复杂，涉及多种细胞因子和生长因子的调控作用，如血管内皮生长因子（vegf），能直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，增加血管通透性；碱性成纤维细胞生长因子（bfgf），能促进内皮细胞的增殖和迁移等。治疗性血管新生疗法是一种通过调节血管生长因子水平，促进缺血组织血管新生的治疗方法。这种疗法在国内外医学界引起了广泛关注，并在临床治疗中显示出巨大潜力。近年来，中医药在这一领域取得了显著进展，如麝香保心丸已被证实具有促进缺血心肌血管新生的作用，可通过调节增加vegf和fgf等血管生成因子的表达，促进血管形成，改善心肌的血液供应。

3、金樱子（ rosa laevigatamichx.）是一种蔷薇科蔷薇属植物，别名刺榆子、糖罐子等，分布于华北、华南等地区，作为一种常用中药，其花、叶、根、果实均可入药。《本草纲目》中有记载：“金樱子，味酸、涩，性平，无毒，主治脾泄下痢，止小便利，涩精气；久服，令人耐寒轻身，补血益精，有奇效”。现代药理学研究表明，金樱子中含有的黄酮、多糖等成分具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。本发明基于中药的药效研究，发现了未曾报道过的中药金樱子促进细胞生长因子表达、血管新生的作用，对于烧烫伤、组织修复、缺血性疾病等问题的临床治疗与应用，具有潜在的积极效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种促进细胞生长因子表达、血管新生的金樱子提取物的制备方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种促进细胞生长因子表达、血管新生的金樱子提取物的制备方法，按以下步骤进行：

4、s1：取干燥的金樱子果实粉碎，加蒸馏水浸提，得提取液；将所得提取液过滤，滤液旋转蒸发浓缩，得浓缩液1；将所得浓缩液1真空冷冻干燥，得冻干粉1，置-20℃储存备用；

5、s2：将步骤s1所得冻干粉1用去离子水溶解，上样于大孔吸附树脂d101层析柱上，吸附完毕后静置结合，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；将所得洗脱液旋转蒸发浓缩，得浓缩液2；将所得浓缩液2真空冷冻干燥，得冻干粉2，即为促进细胞生长因子表达、血管新生的金樱子提取物，置-20℃储存备用；

6、步骤s1中，所述浸提的条件为：金樱子果实与蒸馏水的质量比为1：10，4℃浸提过夜；

7、步骤s1中，所述旋转蒸发浓缩的条件为：转速100rpm，温度55℃，浓缩至原体积的5％；

8、步骤s1中，所述真空冷冻干燥的条件为：温度-50℃，压力50pa，时间48h；

9、步骤s2中，所述吸附洗脱的条件为：将冻干粉1按照2：10的质量比用去离子水溶解，以0.5ml/min的流速上样，用蒸馏水洗脱，洗脱流速为2ml/min，洗脱体积为3倍树脂量；

10、步骤s2中，所述旋转蒸发浓缩的条件为：转速100rpm，温度55℃，浓缩至原体积的5％；

11、步骤s2中，所述真空冷冻干燥的条件为：温度-50℃，压力50pa，时间48h。

12、一种由上述制备方法制得的金樱子提取物。

13、上述一种金樱子提取物的应用，为如下任意一种或多种：

14、1）在制备促进细胞生长因子表达的药物中的应用；

15、2）在制备促进血管新生的药物中的应用；

16、3）在制备治疗创面的药物中的应用；

17、所述细胞生长因子包括血管内皮生长因子a、表皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；

18、所述血管包括创面血管；

19、所述创面包括烧伤、烫伤、外伤后创面、战伤后创面、糖尿病创面、化疗、放疗导致的创面、移植后创面、血管疾病导致的创面、褥疮和冻伤。

20、本发明的显著优点在于：

21、1）大孔吸附树脂d101是一种非极性大孔吸附树脂，‌具有高比表面积、‌高吸附量、‌机械强度好、‌使用寿命长、‌抗有机污染效果好，‌以及容易再生等优势，‌适用于对非极性有机分子的选择性吸附，‌特别是在植提领域中，‌对皂甙类、‌黄酮类、‌多酚类有效成分的吸附分离具有显著效果，对‌糖类、蛋白质、氨基酸、‌无机酸等亲水性有机物均不吸附。考虑到亲水性成分在药物研发中具有显著优势，如高溶解性、生物相容性、稳定性、低毒性与经济性等，本发明采用浸提法制备金樱子水提物，并通过大孔吸附树脂d101分离其中的糖类、氨基酸等亲水性成分，制得一种可在组织水平上上调多种细胞生长因子表达并促进血管新生的金樱子提取物，对于烧烫伤、组织修复、缺血性疾病等问题的临床治疗与应用具有积极促进作用且为首次发现。

22、2）表皮细胞生长因子（egf）具有促进表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等增殖，增强表皮细胞活力，延缓表皮细胞老化等功能，常用于皮肤创面修复，促进肉芽组织上皮化等方面；角质细胞生长因子（kgf）具有促进上皮细胞的增殖和分化，促进伤口愈合等功效；血管内皮生长因子（vegfa）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移与增殖，促进血管生成等作用；碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）具有促进血管内皮细胞、上皮细胞和神经胶质细胞等多种源于中胚层和神经外胚层的细胞分裂与增殖，促进血管新生、创伤愈合与组织修复，参与神经再生等作用。动物试验证实，本发明制备的金樱子提取物能显著上调上述细胞生长因子在组织中的表达水平，在给药20mg/kg/d、80mg/kg/d，给药7d后，可使egf的表达水平分别达到对照的9.4倍、15.4倍，kgf的表达水平分别达到对照的5.2倍、9.7倍，vegfa的表达水平分别达到对照的2.3倍、2.8倍，bfgf的表达水平分别达到对照的2.8倍、3.9倍。

23、3）“血管新生”指化学和机械刺激后，从预先存在的脉管系统中形成新血管的过程。该过程对于许多生理（胚胎发育，排卵，伤口愈合）及病理事件（肿瘤生长，关节炎，糖尿病性视网膜病变）是至关重要的。中医从减轻内皮细胞损伤，促进内皮细胞增殖、成管等方面促进血管新生。但中药促进血管新生作用机制的研究对分子层面涉及较少，且中药单体及复方对血管新生的调节具有双向性，既可以促进血管新生，又可以抑制血管新生，因此，仍需通过基础实验确定其安全剂量及剂型。动物试验证实，本发明制备的金樱子提取物能显著增加小鼠皮肤创面处新生血管的数量，以20mg/kg/d的剂量给药7d、14d后，创面新生血管的数量分别可达到对照的3.3倍、6.0倍；以80mg/kg/d的剂量给药7d、14d后，创面新生血管的数量分别可达到对照的6.3倍、3.8倍。