具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物及其质量检测方法与应用

本发明涉及一种中药，具体涉及具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物及其质量检测方法与应用。

背景技术：

1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是消化系统中常见的恶性肿瘤，其高度侵袭性和转移性质构成了临床治疗的难题。在crc的研究中，缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,hif-1α)作为一个重要的转录因子备受关注，其在低氧环境中的活性上调已被证实与肿瘤的恶性程度密切相关。hif-1α从改变肿瘤细胞的代谢方式、血管生成等方面，促进crc的生长、侵袭和转移。因此，探究hif-1α在crc增殖中的潜在作用机制是十分必要的。

2、充足的能量供应是肿瘤细胞增殖的基础，它决定着肿瘤的生长速率及恶化程度。即使在有氧气的情况下，肿瘤细胞仍采取糖酵解的方式为自身的生长增殖提供能量，这种效应称为“warburg效应”。相比于正常细胞，肿瘤细胞这种低效代谢方式耗费了大量葡萄糖，产生乳酸并形成酸性肿瘤微环境，但同时也能快速合成增殖所需的中间产物。因此，针对肿瘤糖酵解代谢环节成为当前抗肿瘤治疗的重点策略之一。

3、在中医理论中，肿瘤被认为是气滞不畅、血瘀不行所致，日积月累形成的肿块，因而应采用补气活血的药物。黄芪具有益气补血的功效，而莪术能行气破血，两者配伍补而不滞，散中寓收，扶正祛邪，通络活血。传统中药黄芪和莪术因其丰富的药理成分和抗肿瘤活性备受关注。

4、因此，本发明基于黄芪-莪术对结直肠癌代谢活动的影响，探究其对肿瘤生长的影响并剖析其具体作用机制。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，提供一种具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物及其质量检测方法与应用。

2、本发明本研究揭示了黄芪和莪术通过调节hif-1α信号通路来抑制crc增殖的新机制，为crc的治疗提供了新的药物选择和研究方向。这一发现有望为临床实践提供更有效的治疗策略，有助于改善crc患者的预后和生存质量。

3、技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

4、一种具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，它是通过以下方法制备得到的：取一定重量比的黄芪和莪术药材，先加适量水浸泡，随后经过挥发油测定器回流提取，收集挥发油，过滤回流的水提液，浓缩，得浓缩液；剩余药渣再加水进行回流提取，过滤，得到水提液，浓缩，得浓缩液，合并二次浓缩液，将挥发油加入水提液中。

5、作为优选方案，以上所述的一种具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，它是通过以下方法制备得到的：

6、取重量比1～2：1重量的黄芪和莪术药材，先加5～15倍水浸泡10～30min，随后经过挥发油测定器回流提取0.5～2h，收集挥发油，过滤回流的水提液，浓缩，得浓缩液；剩余药渣再加10～15倍水回流提取0.5～1.5h，过滤，得到水提液，浓缩，得浓缩液，合并二次浓缩液，将挥发油加入浓缩液中。

7、作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，它是通过以下方法制备得到的：

8、取一定重量的黄芪和莪术(2：1)药材，先加10倍水浸泡30min，随后经过挥发油测定器回流提取1h，收集挥发油，过滤回流的水提液，浓缩，得浓缩液；剩余药渣再加10倍水回流提取1h，过滤，得到水提液，浓缩，得浓缩液，合并二次浓缩液，将挥发油加入浓缩液中。

9、本发明所述的黄芪和莪术提取物的质量检测方法，包括以下步骤：

10、步骤(1)混合对照品溶液的制备

11、分别精密称取毛蕊异黄酮、芒柄花素、甘草苷、异木栲酚7-o-β-葡萄糖苷、姜黄素、姜黄醇、姜醇、吉马酮、黄芪苷vi、黄芪苷ii，加甲醇配制单个标准品母液，然后分别取一定量的单个标准品母液，混匀，制得混合对照品溶液；

12、步骤(2)供试品溶液的制备

13、取权利要求1～3任一项所述的黄芪和莪术提取物，用80％甲醇-水溶液溶解稀释，通过0.22μm微孔滤膜，得到供试品溶液；

14、步骤(3)取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)黄芪和莪术药对供试品溶液注入uplc-qtof-ms进行分析，通过一级质谱图确定相对分子质量、各标准品的保留时间相关质谱信息，结合提取离子流图，用peak view进行分析。

15、作为优选方案，以上所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)色谱条件为tmuplcbeh c18色谱柱，规格100mm×2.1mm，1.7μm，柱温设定为30℃，流速为0.4ml/min，自动采样器温度为10℃，注射量为2μl，流动相由0.1％甲酸水溶液为a相和乙腈为b相，线性梯度洗脱：从0到2min5-20％b，2到6min 20-45％b，6到12min 45-70％b，12到13min 70-80％b，13到14min，80-100％b。

16、作为优选方案，以上所述的质量检测方法，步骤(1)混合对照品溶液的制备

17、分别精密称取毛蕊异黄酮、芒柄花素、甘草苷、异木栲酚7-o-β-葡萄糖苷、姜黄素、姜黄醇、姜醇、吉马酮、黄芪苷vi、黄芪苷ii，加甲醇配制1mg·ml-1的单个标准品母液，然后分别取一定量的单个标准品母液，混匀，制得100ng·ml-1混合对照品溶液；

18、步骤(2)供试品溶液的制备

19、取权利要求1～3任一项所述的黄芪和莪术提取物，用80％甲醇-水溶液溶解稀释，通过0.22μm微孔滤膜，得到浓度为50mg·ml-1的供试品溶液。

20、有益效果：本发明提供的黄芪和莪术药对的提取物和现有技术相比具有以下优点：

21、(1)本发明根据黄芪和莪术活性成分的结构及其性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，色谱柱、质谱条件等分析条件。

22、(2)hif-1α基因与结直肠癌具有显著关联，其表达水平可能在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用。hif-1α是黄芪-莪术药对的核心作用靶点之一，其与黄芪-莪术药对中其他关键靶点的相互作用可能在结直肠癌治疗中发挥重要作用。

23、(3)本发明构建ct26细胞的原位移植瘤模型验证黄芪-莪术在体内对结直肠癌的抑制作用。结果显示，黄芪-莪术给药组的肿瘤重量和体积减少，生长速度减缓，瘤组织内ki67阳性细胞减少，免疫组化结果显示黄芪-莪术给药组肿瘤组织有大量坏死区域。

24、(4)本发明构建ct26、mc38缺氧模型，进一步验证黄芪-莪术在体外抑制结直肠癌的抑制作用。通过cck8和划痕实验考察黄芪-莪术对结直肠癌细胞的生长。结果表明黄芪-莪术在体外能够显著降低ct26、mc38的细胞活力，抑制细胞增殖。

1.一种具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：取一定重量比的黄芪和莪术药材，先加适量水浸泡，随后经过挥发油测定器回流提取，收集挥发油，过滤回流的水提液，浓缩，得浓缩液；剩余药渣再加水进行回流提取，过滤，得到水提液，浓缩，得浓缩液，合并二次浓缩液，将挥发油加入水提液中。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：

3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的黄芪和莪术提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：

4.权利要求1～3任一项所述的黄芪和莪术提取物的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)色谱条件为tmuplc behc18色谱柱，规格100mm×2.1mm，1.7μm，柱温设定为30℃，流速为0.4ml/min，自动采样器温度为10℃，注射量为2μl，流动相由0.1％甲酸水溶液为a相和乙腈为b相，线性梯度洗脱：从0到2min 5-20％b，2到6min 20-45％b，6到12min 45-70％b，12到13min 70-80％b，13到14min，80-100％b。

6.根据权利要求4所述的质量检测方法，其特征在于，

7.权利要求1～3任一项所述的黄芪和莪术提取物在制备抗结肠癌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，黄芪和莪术提取物通过调节hif-1α基因来抑制结肠癌增殖。

9.黄芪-莪术在通过降低ct26、mc38的细胞活力，抑制结肠癌细胞增殖，发挥抗结肠癌活性。

10.hif-1α基因在制备抗结肠癌中的应用。