一种两亲性功能型纳米复合物及其制备方法和应用

本发明涉及中药制剂领域，尤其涉及一种两亲性功能型纳米复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤的化学动力疗法(chemodynamic therapy，cdt)利用药物将内源性h2o2通过fenton反应转化为高细胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ros)以杀死肿瘤细胞。因其不依赖于外界刺激和局部氧浓度，cdt成为了抑制深部缺氧性肿瘤生长的理想候选疗法。目前阻碍cdt进一步发展的关键是如何在肿瘤部位产生足量的内源性h2o2。

2、蒽环类药物是一类来源于波赛链霉菌青灰变种(streptomyces peucetiusvar.caesius)的化疗药物，蒽环类药物可以与其他化疗药物及分子靶向药物联合应用，以蒽环类药物为基础的联合治疗通常是一线治疗的标准方案；蒽环类药物，包括阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和阿克拉霉素等广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤；蒽环类药物的抗瘤谱广，抗瘤作用强，疗效确切，不可或缺，但是可以引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。

3、目前，单一使用化疗药物存在生物利用度低、肿瘤通透性差、易产生多药耐药性和不受控制的副作用等缺点，严重降低了治疗效果(j nanostruct chem2024,14(1):1-19)。联合治疗作为新兴的治疗手段应运而生，其中化疗和化学动力学(cdt)联合治疗在抑制肿瘤生长方面表现出很好的协同作用(adv sci2020,7(17):2001060；j mater chem b.2017,5(7):1507-1517；biomaterials 2021,275,120962)。基于通过提升细胞内h2o2的浓度从而增强cdt的策略，选择cdt促进药物与蒽环类药物联合使用，基于蒽环类药物具有严重的心、肝和肾毒性等，严重限制了其实际应用(acta biomater 2019,94,469-481；jacccardiooncol 2021,3(3):428-440)。

技术实现思路

1、本发明为了解决上述技术问题，提供一种两亲性功能型纳米复合物及其制备方法和应用，该两亲性功能型纳米复合物分散均匀，形态较好，表面具有较高的负电荷，并且能够在体内环境模拟液中稳定存在；具有更长的血液循环性；到达肿瘤微酸性环境时，发生电荷翻转变为正电荷，更易于与带负电的细胞膜结合；释放效应表明，该两亲性功能型纳米复合物的药物释放具有时间和酸依赖性。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：一方面，提供了一种两亲性功能型纳米复合物，该纳米复合物是基于两亲性聚合物为载体，通过乳化-溶剂挥发法负载化疗药物和cdt促进药物构建而成；其中，所述两亲性聚合物具有以下式(ⅰ)所示的结构：

3、

4、式(i)中，所述n、x、y、m、k均为自然数，n＝10～500，x＝100～300，y＝150～400，m＝1～500，k＝1～500；

5、r为h、为(葡聚糖)或(甘露聚糖)。

6、通过上述技术方案，化疗药物和cdt促进药物通过化疗和cdt作用协同作用于胰腺癌治疗。两亲性聚合物中的疏水性内核为难溶性药物提供了一个天然载药环境。基于所选化疗药物和cdt促进药物均能够提高肿瘤细胞内h2o2的浓度，进而通过载体上偶联的fc催化的fenton反应，产生大量高毒性的·oh，诱导肿瘤细胞死亡。

7、虽然肿瘤细胞具有较高的过氧化氢水平，但肿瘤内h2o2仍不足以产生足够的·oh，以达到令人满意的cdt疗效。此外，肿瘤组织中谷胱甘肽(gsh)浓度较高，作为细胞中一种重要的抗氧化剂，可以清除产生的·oh，削弱cdt作用。因此，在一个纳米平台中同时引入h2o2供应和gsh消除功能有利于提升cdt作用。

8、其中化疗药物dox、二氢青蒿素、顺铂等可以通过氧化还原反应在肿瘤内部提高h2o2浓度。

9、cdt促进药物，是能产生大量h2o2，以实现促进cdt反应的促进药物。

10、cdt反应过程如下：

11、fe3++gsh→fe2++gssg

12、fe2++h2o2→fe3++·oh+oh-

13、该药物体系，通过fe3+与gsh反应，从而降低细胞内gsh含量；通过能提升h2o2浓度的化疗药物和cdt促进药物(提升h2o2浓度)，从而实现cdt疗效提升。

14、进一步地，在步骤1)中，所述两亲性聚合物：化疗药物：cdt促进药物的质量比为5-20:0.02-0.1:1。

15、进一步地，所述化疗药物选用dox、二氢青蒿素、顺铂中的一种或几种。优选地，化疗药物为dox。

16、进一步地，所述cdt促进药物选用vp、β-拉帕醌、胡桃醌中的一种或几种。优选地，cdt促进药物为vp。

17、本发明将抗坏血酸棕榈酸酯(vp)和阿霉素(dox)共载到两亲性功能型纳米复合物内部(vdf nps)，到达肿瘤部位后，局部浓度很高的vp和dox可以迅速提高肿瘤细胞内h2o2的浓度，并进一步通过载体上偶联的二茂铁催化的fenton反应产生高毒性的·oh，协同化疗和化学动力学疗法用于胰腺癌的治疗。该新型纳米载体是通过在葡聚糖(dex)上引入亲水性侧链羧甲基壳聚糖(cmcs)和疏水性侧链二茂铁衍生物(fc)，合成两亲性的功能型载体fc-dex-cmcs。

18、又提供了一种制备上述的两亲性功能型纳米复合物的方法，具体步骤如下：

19、步骤1)两亲性聚合物的合成；

20、步骤2)将步骤1)所得两亲性聚合物溶于纯水内，超声助溶至溶解完全后，冷却至室温，再边冰浴搅拌边将溶有化疗药物和cdt促进药物的有机溶剂加入进行反应，反应温度为25-100℃，反应时间为4-72h；

21、步骤3)将步骤2)所得反应物除去有机溶剂，超声，两级离心，即得两亲性功能型纳米复合物。

22、具体地，基于两亲性聚合物(fdc)的合成，取fdc溶于纯水中，超声助溶，溶解完全后，冷却至室温，冰浴搅拌条件下，将溶有抗坏血酸棕榈酸酯(vp)和阿霉素(dox)的有机溶剂缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应后置于旋转蒸发仪上除去有机溶剂，超声促进粒子分散，取2ml置于超滤离心管中(截留相对分子量：3kd)，然后置于台式低温离心机中，离心分离出溶液中游离的vp和dox，即得vdf nps。

23、优选地，两亲性聚合物(fdc)加热溶解温度为25-100℃；

24、优选地，fdc和vp摩尔比为5-20:1，vp和dox摩尔比为10-50:1；

25、优选地，上述有机溶剂为甲醇或乙醇中的一种；

26、优选地，上述反应温度为25-100℃，时间为4-72h。

27、通过上述技术方案，以fc-dex-cmcs为载体，采用乳化-溶剂挥发法制备vp/dox@fdc nps，具体反应式如下：

28、

29、采用上述制备方法，对于包封率和载药量的影响如下：

30、

31、进一步地，在步骤1)中，所述两亲性聚合物的合成的过程如下：

32、第一步：dex-cho的合成；

33、第二步：dex-cmcs偶联物的合成；

34、第三步：cmcs-dex-cho的合成；

35、第四步：6-氨基己酰二茂铁的合成；

36、第五步：fc-dex-cmcs偶联物的合成，即得。

37、进一步地，在第一步中，原料包含有氧化剂，所述葡聚糖(dex)和氧化剂的摩尔比为1:1-10；所述葡聚糖(dex)的分子量为2-100kda。

38、具体地，将葡聚糖(dex)溶于纯水中，超声使其充分溶解并除去溶液中的空气，n2保护下，缓慢加入氧化剂水溶液，搅拌反应。反应后的溶液倒入8-10kd的透析袋中，透析4次，12h/次。透析结束后用冷冻干燥机进行干燥，得到dex-cho。

39、优选地，氧化剂为乙酸铅、高碘酸钠或者高碘酸中的一种；

40、优选地，上述反应温度为25-100℃，反应时间为4-72h。

41、进一步地，在第二步中，原料包含有羧甲基壳聚糖和还原剂，所述羧甲基壳聚糖：dex-cho的摩尔比为0.5-5:1；所述羧甲基壳聚糖和还原剂摩尔比为1:1-10；所述羧甲基壳聚糖分子量为2-100kda。

42、具体地，羧甲基壳聚糖(cmcs)溶于溶剂中，加热超声促其充分溶解，超声除去空气，冷却后，n2保护下，缓慢加入上述dex-cho，搅拌反应，加入还原剂还原，把还原后的溶液倒入8-10kd的透析袋中，透析4次，12h/次。透析结束后用冷冻干燥机进行干燥，得到dex-cmcs。

43、优选地，上述cmcs加热超声温度为25-100℃；

44、优选地，加入还原剂后反应温度为25-100℃，反应时间为4-72h。

45、优选地，上述溶剂为dmf、dmso或者异丙醇中的一种。

46、优选地，羧甲基壳聚糖和dex-cho反应温度为25-100℃，反应时间为4-72h。

47、优选地，所述还原剂为四氢铝锂、硼氢化钠或者异丙醇铝；

48、进一步地，在第三步中，原料包含有氧化剂，所述dex-cmcs和氧化剂摩尔比为1:20-1:200。

49、具体地，取dex-cmcs溶于纯水中，加热促其充分溶解，超声除去空气，冷却至室温后，n2保护下，缓慢加入氧化剂的水溶液，搅拌反应，把反应后的溶液倒入100-500d的透析袋中，透析4次，12h/次。透析结束后用冷冻干燥机进行干燥，得到cmcs-dex-cho。

50、优选地，上述dex-cmcs溶解温度为25-100℃；

51、优选地，上述氧化剂为乙酸铅、高碘酸钠或者高碘酸中的一种；

52、优选地，上述反应温度为25-100℃，时间为4-72h。

53、进一步地，在第四步中，原料包含有boc-6-氨基己酸和二茂铁，所述boc-6-氨基己酸和二茂铁的摩尔比为0.5-5:1。

54、具体地，取boc-6-氨基己酸置于圆底烧瓶中，冰盐浴条件下，加入干燥的有机溶剂，溶解完全后，加入氯化亚砜，薄层检识，待充分反应后，除去溶剂和过量的氯化亚砜，所得产物无需进一步纯化，直接加入溶有二茂铁的有机溶剂，冰水浴条件下，缓慢加入催化剂，直至溶液颜色变为紫红色，冰浴条件下，继续搅拌反应，反应结束后，冰浴条件下缓慢加入提前预冷的纯水，猝灭分层，有机层旋干后，用有机溶剂复溶后，加入三氟乙酸进行脱boc反应，反应结束后，除去溶剂，进行柱层析得6-氨基己酰二茂铁。

55、优选地，上述boc-6-氨基己酸和氯化亚砜摩尔比为0.5:1-5:1；boc-6-氨基己酸和氯化亚砜反应时间为4-72h。

56、优选地，上述boc-6-氨基己酸和氯化亚砜反应溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或者二硫化碳中的一种。

57、优选地，boc-6-氨基己酸和催化剂摩尔比为0.5:1-1:5；

58、优选地，上述与二茂铁反应催化剂为三氯化铝、氯化锌、三氯化铁或者四氯化钛中的一种；

59、优选地，上述与二茂铁反应所用溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或者二硫化碳中的一种。

60、优选地，上述与二茂铁反应时间为4-72h。

61、优选地，上述与二茂铁反应后柱层析条件为乙酸乙酯：石油醚＝1:10。

62、进一步地，在第五步中，cmcs-dex-cho和6-氨基己酰二茂铁摩尔比为1:20-200。

63、具体地，将cmcs-dex-cho溶于有机溶剂中，加热超声使其充分溶解，待溶解完全，n2保护下，缓慢加入溶有6-氨基己酰二茂铁的有机溶剂，搅拌反应，把反应后的溶液倒入100-500d的透析袋中，透4次，12h/次。透析结束后用冷冻干燥机进行干燥，既得产物fc-dex-cmcs(fdc)。

64、优选地，所述cmcs-dex-cho溶解温度为25-100℃；

65、优选地，所述cmcs-dex-cho和6-氨基己酰二茂铁反应溶剂为dmf、dmso或者乙腈中的一种。

66、优选地，所述cmcs-dex-cho和6-氨基己酰二茂铁反应温度为25-100℃，时间为4-72h。

67、最后，提供了一种上述的两亲性功能型纳米复合物在制备治疗实体肿瘤疾病药物中的应用。优选地，所述实体肿瘤为胰腺癌。

68、通过上述技术方案，涉及胰腺癌联合治疗药物制剂技术领域，其有益效果为：(1)合成的功能型载体，具有较好的生物相容性，能够共载vp和dox制备成纳米药物vdf nps，并具有良好的稳定性和释放效应。(2)vdf nps可以通过ros途径诱导细胞凋亡，与游离药物相比，具有更好的体外抗肿瘤效果。(3)vdf nps在体内能发挥比游离药物更强的抗胰腺癌作用，并且vp和dox的联用能够削弱dox的毒副作用。

69、有益效果

70、本发明合成了基于二茂铁肿瘤微环境响应性的功能型纳米载体，构建为共载vp和dox自组装成载药纳米粒，通过形态、粒径、zate电位和pdi进行表征。结果显示，该纳米复合物分散均匀，形态较好，表面具有较高的负电荷，并且能够在体内环境模拟液中稳定存在。具有更长的血液循环性。到达肿瘤微酸性环境时，发生电荷翻转变为正电荷，更易于与带负电的细胞膜结合。释放效应表明，该纳米复合物的药物释放具有时间和酸依赖性。

71、体外实验结果显示，vp和dox具有良好的协同作用，并且与游离药物相比，在相同时间内，纳米复合物更容易被摄取，这可能得益于纳米复合物优异的粒径和载体上亲水性侧链羧甲基壳聚糖的靶向性。此外，vp和dox均能够提高肿瘤细胞内h2o2的浓度，进而通过载体上偶联的fc催化的fenton反应，产生大量高毒性的·oh，诱导肿瘤细胞死亡。

72、通过小鼠胰腺癌模型探究了vdf nps(两亲性功能型纳米复合物)药物的体内抗肿瘤效果。结果显示，通过尾静脉注射vdf nps药物能够有效地抑制肿瘤生长，同时不会产生系统毒性，这归功于vp与dox的联合使用，能够在不妨碍dox抗肿瘤活性的前提下，削弱dox的毒副作用。此外，vdf nps药物能够直接抑制ki67基因的表达来抑制肿瘤细胞的增殖，还可以抑制gpx4的活性和表达，进而通过ros途径促进细胞凋亡。