一种牛皮癣修复因子制剂的制备方法及应用与流程

本发明涉及治疗牛皮癣制剂领域，尤其涉及一种牛皮癣修复因子制剂的制备方法及应用。

背景技术：

1、牛皮癣是一种常见的免疫介导的炎症性疾病，发病率很高，并对患者的生活质量造成严重影响。作为一种全身性炎症反应，该病患者比一般人群更容易发生代谢紊乱(胰岛素抵抗、动脉粥样硬化性血脂异常、动脉高血压和心血管疾病)，从而导致寿命缩短，且牛皮癣患者出现自杀念头的可能性更高。牛皮癣不仅对患者而且对医疗保健系统构成严重的社会经济负担。疾病发病机制中遗传、表观遗传、免疫和环境因素之间复杂的相互作用尚不完全清楚。近年来，针对牛皮癣发病机制中涉及的关键免疫途径的生物药物的出现，为牛皮癣的治疗提供很大支持。但这些靶向药物并不能完全治愈，且存在一些局限，例如疗效随着时间的推移而下降、出现严重的不良反应以及停药后复发等，导致越来越多的牛皮癣患者对全身治疗无效。因此，迫切需要在严重牛皮癣的治疗和非药物策略方面取得突破。

2、牛皮癣的特征是表皮增生和免疫细胞的真皮浸润，其发病机制很复杂，涉及角质形成细胞、免疫细胞和其他皮肤驻留细胞之间的相互作用。牛皮癣一直被认为是一种免疫细胞驱动的疾病，而角质形成细胞是在牛皮癣发病期间执行免疫细胞功能的执行者，il-23/il-17轴是驱动牛皮癣的关键。浆细胞样树突状细胞的激活促进髓样树突状细胞的成熟和tnf-α、il-12和il-23的产生，从而导致th1和th17的激活以及随后炎症细胞因子的分泌，例如tnf-α、il-17、il-21和il-22。然后角质形成细胞被这些细胞因子激活并产生抗菌肽、细胞因子和趋化因子，从而促进炎症反应。角质形成细胞在牛皮癣的起始和维持阶段都起着至关重要的作用。因此，考虑从调节角质形成细胞为切入点展开对牛皮癣的治疗研究。

3、葡萄糖代谢被认为是牛皮癣的关键代谢机制。葡萄糖的摄取是通过葡萄糖转运蛋白进行的，研究发现，葡萄糖转运蛋白1(glut 1)在患者和咪喹莫特(imq)诱导的银屑病小鼠模型的表皮中显著升高。角质形成细胞特异性删除glut 1不会影响正常皮肤发育和体内平衡，但会改善imq和il-1β诱导的银屑病样增生。此外，局部应用glut 1抑制剂可以减轻银屑病小鼠模型中的皮肤增生和炎症，所以抑制角质形成细胞的葡萄糖代谢可减轻牛皮癣炎症反应。il-23/il-17轴是牛皮癣发病过程中的重要环节，而它们的产生会受到其他细胞因子的调节，胸腺基质淋巴生成素(thymic stromallymphopoietin，tslp)就是其中之一。tslp是一种由上皮细胞(包括角质形成细胞)表达的细胞因子，在皮肤炎症中起重要作用。有研究表明，在牛皮癣患者中tslp过量表达，突变型角质形成细胞分泌的tslp增强了非突变型角质形成细胞的增殖和vegfα的表达，而抑制tslp可以降低这种影响。因此，tslp在牛皮癣炎症发展中对角质形成细胞增殖的调节是牛皮癣的重要标志。在持续的免疫反应过程中，直接激活抑制性treg来调节炎症并防止全身炎症的发展同样至关重要。

4、间充质干细胞(mscs)可分泌负责组织再生和修复组织损伤的营养因子，在皮肤病治疗方面有很好的疗效。但是，研究表明，直接使用msc移植治疗存在较大弊端，显示在其移植后细胞植入率及存活率较低，导致牛皮癣治疗效果较差，炎症反应明显。

技术实现思路

1、本发明是要解决现有方法直接使用msc移植治疗牛皮癣存在治疗效果较差，炎症反应明显的问题，提供一种牛皮癣修复因子制剂的制备方法及应用。

2、本发明牛皮癣修复因子制剂的制备方法，包括以下步骤：

3、一、间充质干细胞的培养

4、自脐带组织中分离华通氏胶，经爬片法获得umscs；

5、取p1代umscs进行纯化，然后用完全培养基在37℃、5％ co2培养箱中培养，在细胞贴壁至60％-80％时，采用强脉冲光处理细胞；

6、二、外泌体的分离提取

7、umscs培养至第三代，待细胞贴壁至50％-60％时，换为无外泌体培养基继续培养，待细胞贴壁生长至90％-100％时，收取细胞培养上清液，提取外泌体；

8、三、制剂的制备

9、将步骤二中提取的外泌体用生理盐水进行稀释，配制成体积浓度为20％-50％的制剂，即为牛皮癣修复因子制剂。

10、进一步的，步骤一所述强脉冲光处理的波长为600-1200nm，脉冲数为三脉冲，脉冲宽度1-15ms，脉冲延迟5-50ms，能量密度15-35mj/cm2。

11、进一步的，步骤一中完全培养基配方为：mem基础培养基+5％helios血清替代物+2iu/ml肝素钠+1％青霉素链霉素。

12、进一步的，步骤二中所述无外泌体培养基是将完全培养基于4℃，以100,000×g超速离心16h后，收集上层2/3体积的培养基，即为无外泌体培养基。

13、进一步的，步骤二中采用超速离心法提取外泌体。

14、进一步的，采用超速离心法提取外泌体的具体步骤为：

15、1、将收集的细胞培养上清液离心去除活细胞；

16、2、以4℃，2,000×g离心去除死细胞；

17、3、以4℃，10,000×g离心去除细胞碎片；

18、4、然后将上清液转移至超滤管中，离心收集浓缩液；

19、5、对收集的浓缩液的超滤管外壁进行消毒，移至超净台中，过滤转移至超速离心管中；

20、6、以4℃，100,000×g超速离心75min，保留管底沉淀；

21、7、加入pbs重悬，以4℃，100,000×g离心75min，保留管底沉淀；

22、8、用预冷的pbs重悬沉淀，即为外泌体，-80℃保存备用。

23、本发明提供牛皮癣修复因子制剂在制备治疗牛皮癣药物中的应用。

24、本发明提供牛皮癣修复因子制剂抑制角质形成细胞glut 1表达中的应用。

25、本发明提供牛皮癣修复因子制剂抑制角质形成细胞分泌tslp中的应用。

26、本发明提供牛皮癣修复因子制剂促进treg细胞增殖分化中的应用。

27、本发明的有益效果：

28、1、本发明在mscs培养过程中，对mscs进行强脉冲光处理，促进mscs外泌体的分泌，提高外泌体中牛皮癣修复因子的含量，所述牛皮癣修复因子为胰岛素样生长因子-1(igf-1)、白细胞介素10(il-10)和细胞因子信号传导抑制因子3(socs-3)等。对牛皮癣发展过程中的病变角质形成细胞起到良好的调节作用，通过免疫及代谢等途径，激活机体皮肤免疫自愈能力，从而起到改善牛皮癣的作用。

29、2、本发明提取强脉冲光处理后的mscs所分泌的外泌体，其可抑制牛皮癣发展过程中急剧增加的glut 1的表达，通过调节葡萄糖代谢，抑制角质形成细胞过度增殖及炎症发展，从而减轻牛皮癣的增生及炎症的发生发展。

30、3、本发明提取的外泌体可在牛皮癣发展过程中抑制角质形成细胞分泌tslp，从而减少细胞增殖并减轻皮肤炎症，达到改善牛皮癣的作用。

31、4、本发明提取强脉冲光处理后的mscs所分泌的外泌体，其可在牛皮癣炎症发展中促进treg细胞增殖分化，使功能受损的treg细胞恢复免疫抑制特性，调节机体免疫稳态，唤醒皮肤免疫功能，起到减轻牛皮癣炎症的作用。

32、5、本发明牛皮癣修复因子制剂由强脉冲光处理后的mscs所分泌的外泌体制备而成。利用强脉冲光的特殊条件，使mscs发生特异性变化，致使其外泌体中富含调节牛皮癣炎症的皮肤自愈因子，通过免疫调节及葡萄糖代谢等途径减轻牛皮癣的炎症发展，从而改善牛皮癣症状，为牛皮癣等皮肤病的治疗提供新的思路。