一种大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶的制备方法及应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种大蒜蛋白水解产物(gph)与海藻酸钠(sa)双交联形成的可作为良好肠靶向药物递送体系的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、水凝胶是一种三维网络结构的凝胶，极具亲水力，可以在水中迅速溶胀且不溶解。目前，水凝胶因其优越的性能，被广泛地研究、应用作药物递送的重要载体。然而，凝胶本体不容易分散在不同的基质中，在胃肠道均匀吸附方面也有局限性。研究表明，由天然生物聚合物(多糖或蛋白质等)形成的水凝胶具有理想的生物相容性，肽的氨基酸组成、疏水性和静电点等均可影响凝胶的形成。蛋白(肽)制备的水凝胶易于降解，且结构不稳定，在生理条件下容易被消化，而添加多糖后可以克服这些缺点，为水凝胶系统形成更稳定的网络。

2、目前，大豆蛋白水解物制成的ph响应性水凝胶在酸碱性环境中较大的溶胀差异可能会导致肽电荷、分子量和链长等方面的变化，影响到药物的持续稳定释放；同时水凝胶的载药量和包封效率一般，在临床治疗上会产生资源浪费，因此需要开发出一种能够持续稳定靶向释放且具有较高载药量和包封效率的水凝胶。大蒜蛋白是大蒜的主要成分之一，具有抗动脉粥样硬化、抗过氧化物活性、抗菌消炎等作用。但在实际生活中大蒜蛋白的应用较少，造成资源浪费。酶水解不仅具有辅助改善蛋白质功能特性，提高其溶解度、改变发泡能力和凝胶化能力等作用，还可以改善蛋白质物理性质，目前被广泛用于蛋白质的修饰及改性。酶水解后的大蒜蛋白具有很好的生物活性，如显著的抗氧化活性和抗高血压能力等，为后续的研究应用打下良好的基础。但大蒜蛋白水解产物还没有被开发成产品在食品或医疗行业中应用，也从未应用于水凝胶的形成和药物递送系统，因此基于大蒜蛋白水解物的新型水凝胶的研发具有重要价值。双交联水凝胶是一种新型的高分子材料，通常由两种或两种以上的交联结构组成，具有优异的物理、化学性质，如更高的交联密度、更强的稳定性、更高的吸水性和更高的生物相容性，因此具有更加广泛的应用前景。许多活性成分如姜黄素在疾病治疗包括抗癌抗炎中占据重要位置，但由于其化学不稳定、生物利用度低和水溶性差等功能缺陷，限制了在食品或医药行业的进一步应用。将这些活性成分负载在水凝胶上可以改善其功能缺陷，控制它们在消化过程中的释放，提高其利用价值等。

技术实现思路

1、为了丰富现有的水凝胶材料，拓宽大蒜蛋白在药学和营养学方面中的应用，本发明提供一种大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶的制备方法及应用，解决部分脂溶性模式药物化学不稳定、水溶性差、生物利用度低的问题，提高其肠靶向释放能力。

2、本发明的技术方案为：

3、一种大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)：以大蒜鳞茎为原料，提取大蒜蛋白；

5、(2)：将步骤(1)得到的大蒜蛋白经过胰蛋白酶水解获得大蒜蛋白水解产物；

6、(3)：以大蒜蛋白水解产物、海藻酸钠为原料，在氯化钙溶液的辅助下制备双交联肠靶向水凝胶。

7、所述步骤(1)大蒜蛋白提取包括下述步骤：将大蒜鳞茎粉碎成颗粒，风干，用水进行提取；提取后将混合物合并、离心，取上清液，调节ph＝4-5进行沉淀、离心获得沉淀物，再将沉淀物重新溶解在去离子水中，调节ph至6.5-7.5；之后，使用脱脂溶剂将上述含沉淀物的溶液脱脂，离心获得脱脂蛋白质，再用去离子水重新溶解脱脂蛋白，冷冻干燥，得到脱脂蛋白质固体。

8、所述步骤(2)所述的大蒜蛋白水解产物制备包括下述步骤：使用胰蛋白酶水解脱脂蛋白质固体制备大蒜蛋白水解产物；水解后，在沸水浴中加热以终止反应，将水解液离心以去除不溶性物质，收集上清液，用纤维素透析膜在去离子水中透析过夜，收集样品进行冷冻干燥，即得大蒜蛋白水解产物。

9、所述步骤(3)大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶的制备包括下述步骤：将(2)中所得固体的大蒜蛋白水解产物溶于去离子水中，搅拌后离心去除不溶性物质；海藻酸钠(sa)充分溶解于去离子水中后，将海藻酸钠溶液与去除过不溶性物质的大蒜蛋白水解产物溶液混合充分，再对终溶液进行超声去除气泡；将溶液以0.5-2.0ml/min的速度挤压到氯化钙溶液中得到珠粒，12-24h孵育之后使其在氯化钙溶液中完全凝胶化，收获凝胶化的珠粒，并用去离子水洗涤数次，通过抽滤去除表面水，得到双交联肠靶向水凝胶。

10、所述步骤(3)所得水凝胶需要内部呈现蜂窝状和有序的多孔形式，储能模量恒高于损耗模量，在酸性环境中收缩且溶胀率介于-10％至0，而在碱性环境膨胀且具有溶胀稳定性，实现肠道靶向释放，才能以此为载体。

11、本发明中的离心条件优选为转速3000-13000g、时长5-30min；

12、调节ph调节使用酸性、碱性试剂进行，例如hcl和naoh；

13、所述步骤(1)中的大蒜鳞茎为农贸市场上可直接购买的，剥去外皮即可；含沉淀物的溶液和脱脂溶剂的体积比例以含沉淀物的溶液：脱脂溶剂＝1:3-10为优选；脱脂溶剂包括以下溶剂：正己烷、乙醚、丙酮、甲苯、三氯乙烯、四氯化碳、乙酸乙酯、石油醚。

14、所述步骤(2)中的脱脂蛋白质固体和胰蛋白酶的质量比例以脱脂蛋白质固体：胰蛋白酶＝150-300:1为优选；大蒜蛋白水解ph在7-8、时长在60-150min区间为优选，水解期间需要维持ph值稳定；胰蛋白酶和纤维素透析膜可直接购买使用。

15、所述步骤(3)中固体的大蒜蛋白水解产物在去离子水中的溶解比例以6-15％为优选；海藻酸钠在去离子水中的溶解比例以1-4％为优选；海藻酸钠溶液与去除过不溶性物质的大蒜蛋白水解产物溶液的体积比例以海藻酸钠溶液：去除过不溶性物质的大蒜蛋白水解产物溶液＝1-4:1为优选；氯化钙在去离子水中的溶解比例以1-4％为优选；

16、本发明的方法制备的大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶负载脂溶性模式药物的应用。

17、负载的脂溶性模式药物包括姜黄素(curcumin)、紫杉醇(ptx)、大蒜素(allicin)、大黄素(emodin)、原花青素(procyanidins)、辣椒素(capsaicin)、槲皮素(quercetin)。

18、本发明的大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶负载姜黄素的应用，具体负载方法：将姜黄素先溶解在二甲基亚砜中，再溶解在去离子水中；将步骤(3)中双交联肠靶向水凝胶溶胀在含有姜黄素的去离子水中，常温振荡12-36h，离心，弃上清液，将沉淀的水凝胶烘干，得到负载有姜黄素的双交联肠靶向水凝胶。

19、姜黄素和大蒜蛋白水解产物的质量比例以姜黄素：大蒜蛋白水解产物＝1:5-100为优选。

20、本发明的大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联肠靶向水凝胶的应用，包括作为脂溶性模式药物载体、有效改善现有脂溶性模式药物及营养成分化学不稳定、水溶性差、生物利用度低的问题，提高肠道靶向释放能力，拓宽大蒜蛋白在药物及营养成分和高效传递方面中的应用。

21、本发明的有益效果为：

22、(1)本发明制备的大蒜蛋白水解产物具有良好的水解度，水解暴露出的官能团可以在水凝胶中形成更多的氢键，使水凝胶的稳定性得到提高。与海藻酸钠双交联形成的肠靶向水凝胶具有良好的流变性能，弹性和内聚性稳定，大蒜蛋白水解产物的加入增强了凝胶的硬度、咀嚼性和粘性。形成的双交联水凝胶呈现具有小孔的立体蜂窝状结构，孔隙形态较有序，其内部的孔洞可能是不溶性或不稳定的药物的理想承载点。

23、(2)大蒜蛋白水解产物的加入使水凝胶珠粒对环境ph变化更敏感，更倾向于分散在碱性溶液(如肠)中，且水凝胶在碱性环境中的溶胀稳定性得到明显提高，有利于负载药物的持续稳定释放，具有肠靶向潜力，可以作为肠道靶向药物，达到治疗的目的。

24、(3)本发明对大蒜蛋白水解产物与海藻酸钠双交联水凝胶进行溶胀率、药物包封效率实验及体外模拟消化实验。测试结果表明，本发明所制备的水凝胶可以很好地改善姜黄素的溶解性，药物包封率达总药物添加量的75％左右，载药效率高。在体外模拟消化实验中姜黄素在胃环境中几乎不会释放，而在肠液环境中释放率较高，因此，本发明的水凝胶可以更加有效地控制药物在肠道条件下的释放，可作为一种良好的肠靶向药物递送体系。