一种基于费式弧菌评价中药配伍毒性的模型及其构建方法和应用

本发明属于毒性评价，涉及一种基于评价中药配伍毒性的模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、中药是我国的瑰宝，在防病治病和养生保健等方面发挥了巨大的作用。随着中药及其制剂应用范围的扩大，临床报道其引发的不良反应也日益增多，并有致死的报道。

2、吴茱萸是临床常用“小毒”中药，一方面，吴茱萸的药效作用明确，既是治疗肝寒气滞诸痛的主药，又是治疗脾胃阳虚、五更泄泻的常用药，现代药理研究表明吴茱萸具有抗炎、抗肿瘤和心脏保护等作用；另一方面，吴茱萸具有潜在的毒性，古代多部经典医书中对其有“小毒”的描述，现代研究也证实其具有肝毒性。

3、补骨脂是中医常用的一味温肾助阳的良药，化学成分主要为黄酮类、香豆素类、单萜酚类、苯并呋喃类和其他类等，具抗癌、抗炎、抗骨质疏松、降血糖等活性，还具免疫调节、抑菌和保护心血管等作用。近年来，临床上使用补骨脂及其制剂的患者会出现肝、肾和生殖毒性等副作用，研究表明，补骨脂苷、补骨脂酚、补骨脂素等是补骨脂毒性的主要物质基础。

4、研究人员利用发光细菌的发光强度对中药毒性进行研究，建立了基于microtox技术的生物测试方法，利用发光细菌独特的生理特性与现代光电检测技术相结合来检测毒性物质。microtox技术已成功应用于鱼腥草注射液、生脉注射液等中药注射剂以及苍耳子、山金银花、金银花、汤剂等药材的综合毒性检测；但microtox技术检测中存以下缺点：第一：所需的毒性检测仪器，例如生物毒性分析仪microtox model 500价格昂贵，导致毒性检测成本较高；第二：改方法基于水质毒性检测的检测管为待测液的载体去做毒性评定，需要用到大量发光菌菌液，造成浪费；第三，部分水质毒性检测仪无法在短时间内做到多个样本批量检测，难以控制样品于发光菌作用时间的统一性。最后，该仪器主要是用于水质的毒性检测，在中药毒性中的应用较少且未见在配伍中药中研究毒性变化趋势。

5、因此，本领域技术人员渴望研发一种能够快速、可重复、经济高效评价吴茱萸及其配伍和补骨脂及其配伍毒性的方法。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术中缺少能够快速、可重复、经济高效评价吴茱萸和补骨脂及其配伍毒性方法的技术问题，提供了一种基于费式弧菌评价中药配伍毒性的模型及其构建方法和应用。

2、本发明的目的之一在于提供一种基于费式弧菌评价中药配伍毒性模型的构建方法，所述构建方法具体包括以下步骤：

3、s1：根据中药配方制备中药配伍溶液，向上述中药配伍溶液中加入渗透压调节液获得待测液；

4、s2：向费氏弧菌中加入菌体复苏液，混匀后静置5min，获得费氏弧菌液；

5、s3：向s1中获得的待测液中加入s2中获得的费氏弧菌液，反应15min后，对获得的反应液进行发光强度的检测评价待测验的毒性。

6、在本发明的一个优选实施例中，s1中所述中药配方为：吴茱萸、左金丸、吴茱萸汤、补骨脂、二神丸或四神丸中的任意一种；

7、所述左金丸是由吴茱萸和黄连按照6：1的质量比混合组成；

8、所述吴茱萸汤是由吴茱萸、生姜、人参和大枣按照3：6：3：4的质量比混合组成；

9、所述二神丸是由盐补骨脂、煨肉豆蔻、大枣和生姜按照2：1：1：1的质量比混合组成；

10、所述四神丸是由盐补骨脂、煨肉豆蔻、醋制五味子、制吴茱萸、大枣和生姜按照4：2：2：1：2：2的质量比混合组成。

11、在本发明的一个优选实施例中，s1中所述中药配伍溶液的制备方法为：根据中药配方将中药浸泡在10倍体积的超纯水中浸泡8h，然后加热煮沸2次，每次煮沸过程持续1h，过滤后获得中药配伍溶液。

12、在本发明的一个优选实施例中，s1中所述中药配伍溶液与渗透压调节液的添加体积比为10μl：1μl。

13、在本发明的一个优选实施例中，所述渗透压调节液为20％的氯化钠溶液。

14、在本发明的一个优选实施例中，s2中所述菌体复苏液为浓度为2％的氯化钠，所述氯化钠的添加量为1管费氏弧菌中需加入3ml氯化钠溶液。

15、在本发明的一个优选实施例中，s3中所述费氏弧菌液的添加量为20ul。

16、在本发明的一个优选实施例中，s3中所述评价待测液毒性的方法是通过待测液发光强度检测结果ic50判断待测液的毒性，待测液的ic50值与其毒性成反比。

17、本发明的目的之二在于提供上述构建方法获得的评价中药配伍毒性的模型。

18、本发明的目的之三在于提供上述模型在评价吴茱萸及其配伍和补骨脂及其配伍毒性中的应用。

19、本发明的有益效果：费氏弧菌是一种海洋发光细菌，具有灵敏度高、时效性好、成本低、操作简单、使用范围广(有机、无机化合物等)等优点，在水质毒性监测中得到广泛应用，但在中药配伍毒性检测方面未见报道。

20、本发明提供了一种基于费式弧菌评价中药配伍毒性的模型及其构建方法和应用，所述模型通过生物发光强度检测中药对费式弧菌的生物发光抑制率，所获得的ic50值越小，抑制费式弧菌50％生物发光所需的中药及其配伍的浓度越低，则表明该中药及其配伍潜在毒性越大。

21、本发明基于费式弧菌的发光原理，使用多功能酶标仪作为毒性检测仪器，通过改进实验方法及样品和发光菌液用量，实现在多功能酶标仪上进行发光抑制率的检测，以便扩大研究范围，降低使用成本，其次，本发明对待测液的载体替换为96孔板，降低了发光菌液的消耗，可进行多次批量检测和重复实验，提高毒性检测效率。本发明所提供的评价模型可检测中药的微量毒性，可应用于评价吴茱萸及其配伍和补骨脂及其配伍的毒性，具有流程简单、操作简便、检测周期短的特点，其检测结果准确度较高，灵敏度较高。

1.一种基于费式弧菌评价中药配伍毒性模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1中所述中药配方为：吴茱萸、左金丸、吴茱萸汤、补骨脂、二神丸或四神丸中的任意一种；

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1中所述中药配伍溶液的制备方法为：根据中药配方将中药浸泡在10倍体积的超纯水中浸泡8h，然后加热煮沸2次，每次煮沸过程持续1h，过滤后获得中药配伍溶液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1中所述中药配伍溶液与渗透压调节液的添加体积比为10μl：1μl。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述渗透压调节液为20％的氯化钠溶液。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s2中所述菌体复苏液为浓度为2％的氯化钠，所述氯化钠的添加量为1管费氏弧菌中需加入3ml氯化钠溶液。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s3中所述费氏弧菌液的添加量为20ul。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s3中所述评价待测液毒性的方法是通过待测液发光强度检测结果ic50判断待测液的毒性，待测液的ic50值与其毒性成反比。

9.权利要求1至8任意一项所述构建方法获得的评价中药配伍毒性的模型。

10.权利要求9所述的模型在评价吴茱萸及其配伍和补骨脂及其配伍毒性中的应用。