AAV介导的治疗性抗体到内耳的递送的制作方法

本公开总体上涉及使用核酸治疗人受试者中的听力损失。

背景技术：

0、发明背景

1、感音神经性听力损失是由哺乳动物内耳中的细胞(例如，毛细胞)功能失调引起的听力损失。感音神经性听力损失的非限制性原因包括暴露于大的噪音、头部创伤、病毒感染、自身免疫性内耳疾病、遗传性听力损失、衰老、内耳畸形、梅尼埃病、耳硬化症和肿瘤。

技术实现思路

1、本发明涉及包括将治疗有效量的任何腺相关病毒(aav)载体引入哺乳动物(例如，人)的内耳中的方法，所述aav载体包括编码以下多肽的核苷酸序列：(a)包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽；或(b)包括可操作地连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽。

2、本文提供了用于提高对其有需要的哺乳动物的内耳中的抗体或抗原结合抗体片段的水平的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码以下多肽的核苷酸序列：(a)包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽；或(b)包括连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽；其中引入使得哺乳动物的内耳中抗体或抗原结合抗体片段的水平升高。

3、在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合血管内皮生长因子(vegf)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段降低vegf活性。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码抗体或抗原结合抗体片段的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。

4、在一些实施方案中，aav载体包括选自由以下组成的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

5、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定为患有内耳病症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被诊断为患有内耳病症。

6、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽。

7、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号的抗原结合抗体片段的多肽。

8、本文还提供了用于治疗对其有需要的哺乳动物中的内耳病症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码以下多肽的核苷酸序列：(a)包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽；或(b)包括连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽；其中引入使得哺乳动物中的内耳病症得到治疗。

9、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码抗体或抗原结合抗体片段的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。

10、在一些实施方案中，aav载体包括选自由以下组成的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。

11、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

12、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定为患有内耳病症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被诊断为患有内耳病症。

13、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽。

14、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号的抗原结合抗体片段的多肽。

15、本文还提供了降低对其有需要的哺乳动物的内耳中vegf活性的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码以下多肽的核苷酸序列：(a)包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽；或(b)包括连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽；其中(a)的多肽编码特异性结合到vegf并降低vegf活性的抗体，(b)的多肽编码特异性结合到vegf并降低vegf活性的抗原结合抗体片段；其中引入使得哺乳动物的内耳中vegf活性降低。

16、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码抗体或抗原结合抗体片段的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。

17、在一些实施方案中，aav载体包括选自由以下组成的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。

18、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。

19、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有听神经瘤。在一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有前庭神经鞘瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有2型神经纤维瘤病。

20、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽。

21、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽。

22、本文还提供了治疗哺乳动物的内耳中听神经瘤、前庭神经鞘瘤或2型神经纤维瘤病的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码以下多肽的核苷酸序列：(a)包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽；或(b)包括连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽；其中(a)的多肽编码特异性结合到vegf并降低vegf活性的抗体，(b)的多肽编码特异性结合到vegf并降低vegf活性的抗原结合抗体片段；其中引入使得哺乳动物的内耳中听神经瘤、前庭神经鞘瘤或ii型神经纤维瘤病分别得到治疗。

23、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码抗体或抗原结合抗体片段的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。

24、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括选自由以下组成的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。

25、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

26、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有听神经瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有前庭神经鞘瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有2型神经纤维瘤病。

27、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗体重链可变结构域的多肽以及包括可操作地连接到信号肽的抗体轻链可变结构域的多肽。

28、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括编码以下多肽的核酸序列：包括可操作地连接到信号肽的抗原结合抗体片段的多肽。

29、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，抗体包括有包括一个或多个氨基酸置换的fc区，与对照抗体相比，所述氨基酸置换缩短了哺乳动物中抗体的半衰期；或

30、与对照抗原结合抗体片段相比，所述抗体的抗原结合抗体片段的体内半衰期缩短。

31、本文还提供了包括将治疗有效量的腺相关病毒(aav)载体引入哺乳动物的内耳中的方法，所述aav载体包括编码可操作地连接到信号肽的可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体的核苷酸序列。

32、本文还提供了用于提高对其有需要的哺乳动物的内耳中可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体水平的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码可操作地连接到信号肽的可溶性vegf受体的核苷酸序列；其中引入使得哺乳动物的内耳中可溶性vegf受体水平升高。

33、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-1(vegfr-1)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-1的连续序列有至少90％同一性的序列。

34、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-2(vegfr-2)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-2的连续序列有至少90％同一性的序列。

35、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegfr-1的胞外区的一部分和vegfr-2的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域；并且vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体为阿柏西普(aflibercept)。

36、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-3(vegfr-3)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-3的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-3的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-3的连续序列有至少90％同一性的序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括fc结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，fc结构域为igg1 fc结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，igg1 fc结构域为人野生型igg1 fc结构域。

37、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体降低了vegf结合到vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3中的一者或多者的能力。

38、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码可溶性vegf受体的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括选自以下的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

39、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定为患有内耳病症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被诊断为患有内耳病症。

40、本文还提供了用于治疗对其有需要的哺乳动物中的内耳病症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码可操作地连接到信号肽的可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体的核苷酸序列；其中引入使得哺乳动物中的内耳病症得到治疗。

41、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码可溶性vegf受体的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括选自以下的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

42、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定为患有内耳病症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被诊断为患有内耳病症。

43、本文还提供了降低对其有需要的哺乳动物的内耳中vegf活性的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码可操作地连接到信号肽的可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体的核苷酸序列；其中引入使得哺乳动物的内耳中vegf活性降低。

44、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码可溶性vegf受体的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括选自以下的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

45、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有听神经瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有前庭神经鞘瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有2型神经纤维瘤病。

46、本文还提供了治疗哺乳动物的内耳中听神经瘤、前庭神经鞘瘤或2型神经纤维瘤病的方法，所述方法包括：将治疗有效量的aav载体引入哺乳动物的内耳中，所述aav载体包括编码可操作地连接到信号肽的可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体的核苷酸序列；其中引入使得哺乳动物的内耳中听神经瘤、前庭神经鞘瘤或ii型神经纤维瘤病分别得到治疗。

47、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括可操作地连接到编码可溶性vegf受体的序列的启动子和kozak序列中的一者或两者。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体包括选自以下的组的启动子：诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括多聚腺苷酸化信号序列。

48、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物为人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有听神经瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有前庭神经鞘瘤。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物已被鉴定或诊断为患有2型神经纤维瘤病。

49、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-1(vegfr-1)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-1的连续序列有至少90％同一性的序列。

50、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-2(vegfr-2)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-2的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-2的连续序列有至少90％同一性的序列。

51、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegfr-1的胞外区的一部分和vegfr-2的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-1的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域；并且vegfr-2的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体为阿柏西普。

52、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括vegf受体-3(vegfr-3)的胞外区的一部分。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-3的连续序列。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括来自野生型人vegfr-3的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，vegfr-3的胞外区的一部分包括与来自野生型人vegfr-3的连续序列有至少90％同一性的序列。

53、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体包括fc结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，fc结构域为igg1 fc结构域。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，igg1fc结构域为人野生型igg1 fc结构域。

54、在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可溶性vegf受体降低了vegf结合到vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3中的一者或多者的能力。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，aav载体还包括分泌序列。

55、除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式并因此编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。

56、术语“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是相同的与其天然状态的共存物质部分或完全分离的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或可存在于非天然环境中，例如像，宿主细胞中。

57、术语“转染的”、“转化的”或“转导的”是指将外源性核酸转移或引入细胞的过程。“转染的”、“转化的”或“转导的”哺乳动物细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。

58、术语“表达”是指编码蛋白质的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

59、术语“瞬时表达”是指短时间(例如，数小时或数天)内非整合编码序列的表达。在细胞(例如，哺乳动物细胞)中瞬时表达的编码序列在多轮细胞分裂后丢失。

60、术语“受试者”旨在包括任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)、兔子、绵羊、山羊、猪、狗、猫、非人灵长类动物或人。在一些实施方案中，受试者患有非综合征性耳聋或有发展为非综合征性耳聋的风险。在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为患有内耳病症。在一些实施方案中，受试者先前已被诊断为患有内耳病症。在一些实施方案中，受试者已被鉴定为患有药物性听力损失。在一些实施方案中，受试者为婴儿(例如，人类婴儿)。

61、当治疗使得受试者(例如，人)中疾病的一种或多种症状(例如，无症状感音神经性听力损失)的数量、严重程度和频率中的一种或多种减少时，所述治疗为“治疗有效的”。

62、术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)或其组合。除非明确限制，否则术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核苷酸类似的结合特性。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地包括互补序列以及明确指出的序列。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸为dna。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸为rna。

63、术语“信号肽”是指存在于新生分泌蛋白的n端但不存在于天然存在的成熟蛋白中的序列。在信号肽被翻译后，“信号肽”被蛋白酶(例如，信号肽酶)裂解。信号肽在本领域中是已知的。信号肽的非限制性实例包括：meffkktalaalvmgfsgaala(seq id no:9)和mkyllptaaagllllaaqpama(seq id no:10)。

64、术语“内耳病症”是指由哺乳动物的内耳中或周围的细胞(例如，毛细胞、支持细胞、螺旋神经节神经元、巨噬细胞或雪旺式细胞)的功能障碍引起的病症。内耳病症的非限制性实例包括，例如，感音神经性听力损失(snhl)、噪声性听力损失、药物性听力损失、年龄相关性听力损失、听神经瘤、2型神经纤维瘤病、听觉神经病、噪声性耳蜗突触病而无毛细胞缺失、年龄相关性耳蜗突触病、获得性感音神经性听力损失和前庭神经鞘瘤。参见，例如，kujawa等人,hear res330(0 0):191-199,2015；和suzuki等人,scientific reports 6:24907。本文描述了内耳病症的非限制性实例，并且内耳病症的其他实例在本领域中是已知的。

65、术语“抗体”意指相互作用以形成至少一个抗原结合结构域的两个或更多个单多肽链的复合物。抗体的非限制性实例包括单克隆抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性、三特异性等抗体，只要其表现出所需的生物学活性即可)。抗体可以是人、人源化的和/或亲和力成熟的。

66、术语“抗原结合抗体片段”是单一多肽，其包括构成至少一个抗原结合结构域(例如，scfv)的所有氨基酸。

67、如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体获得的抗体，即，包含该群体的各个抗体是相同的，不同的是可以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体具有高度特异性(针对单一抗原)。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

68、本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，以及此类抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源于其他物种或属于其他抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，只要其表现出所需的生物学活性即可(参见，例如，美国专利号4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855(1984))。

69、“抗原结合结构域”是一个或多个能够特异性结合到一种或多种不同抗原的蛋白质结构域(例如，由单一多肽的氨基酸形成或由两个或更多个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成。在一些实例中，抗原结合结构域可以与天然存在的抗体类似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域可包括替代支架。本文描述了抗原结合结构域的非限制性实例。抗原结合结构域的其他实例在本领域中是已知的。在一些实例中，抗原结合结构域可结合到单一抗原。

70、“亲和力”是指抗原结合位点与其结合伴侣(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“亲和力”是指反映抗原结合结构域的成员与抗原或表位之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其伴侣y的亲和力可用解离平衡常数(kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。亲和力可例如使用表面等离子体共振(spr)技术(例如，)或生物层干涉法(例如，)来测定。用于测定抗原结合结构域与其对应的抗原或表位之间的亲和力的其他方法在本领域中是已知的。

71、短语“半衰期”是指在哺乳动物(例如，本文所述的任何哺乳动物)的循环(例如，血液)中的抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的半衰期，并且由从循环中清除50％的抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体所需的时间表示。在一些实施方案中，通过比较受试者中抗体、抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的半衰期与类似哺乳动物中对照抗体、对照抗原结合抗体片段或对照可溶性vegf受体的半衰期来测定半衰期的改变(例如，抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的半衰期的减少)。

72、在一些实施方案中，通过在全身性施用(例如，静脉内施用)本文所述的任何aav载体后的不同时间点，测量从受试者获得的样品(例如，血液样品)中抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的水平来测定哺乳动物中抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的半衰期。在一些实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域已知的另一种测定来测定从哺乳动物获得的样品中存在的抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的水平，并且使用软件程序(例如，graphpad prism)将样品中存在的抗体、其抗原结合抗体片段或可溶性vegf受体的测定水平作为时间函数作图。

73、术语“vegf活性”是指vegf蛋白的一种或多种已知活性。例如，vegf蛋白的一种活性是结合到一种或多种vegf受体的能力。在另一个实例中，vegf蛋白的一种活性是vegf在表达vegf受体的哺乳动物细胞中触发下游信号转导途径的能力。用于检测vegf的一种或多种活性的方法在本领域中是已知的。

74、术语“可溶性vegf受体”是指包括可操作地连接到信号肽的一种或多种哺乳动物vegf受体(例如，vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3)的胞外区的一部分的多肽，其中可溶性vegf受体能够特异性结合到一种或多种哺乳动物vegf蛋白(例如，vegf-a、vegf-b、vegf-c和vegf-d中的一个或多个)。在一些实例中，可溶性vegf受体包括vegfr-1的胞外区的一部分(例如，来自野生型人vegfr-1的连续序列(例如，来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域)或与来自野生型人vegfr-1的连续序列有至少90％同一性的序列)。在一些实例中，可溶性vegf受体包括vegfr-2的胞外区的一部分(例如，来自野生型人vegfr-2的连续序列(例如，来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域)或与来自野生型人vegfr-2的连续序列有至少90％同一性的序列)。在一些实例中，可溶性vegf受体包括vegfr-1的胞外区的一部分和vegfr-2的胞外区的一部分(例如，来自野生型人vegfr-1的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域以及来自野生型人vegfr-2的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域)(例如，阿柏西普)。在一些实例中，可溶性vegf受体包括vegfr-3的胞外区的一部分(例如，来自野生型人vegfr-3的连续序列(例如，来自野生型人vegfr-3的胞外区中的一个或多个免疫球蛋白样结构域)或与来自野生型人vegfr-3的连续序列有至少90％同一性的序列)。

75、在一些实例中，可溶性vegf受体还可包括稳定结构域(例如，fc结构域，诸如igg1fc结构域(例如，人野生型igg1 fc结构域)。在一些实例中，可溶性vegf受体降低vegf结合到vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3中的一个或多个(例如，两个或三个)的能力。除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域内的普通技术人员对于该发明所属的通常理解的意义相同的意义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的而不是旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以引用方式整体并入。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。