一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物及其制备方法

本发明属于生物工程，尤其涉及一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物及其制备方法。

背景技术：

1、皮肤填充是美容医学中常见的一种治疗方法，旨在改善皮肤外观、减少皱纹和细纹、恢复面部体积或改善面部轮廓，常用的填充材料包括透明质酸(hyaluronic acid，ha)、钙羟基磷灰石、聚左乳酸及胶原蛋白等。其中，胶原蛋白作为天然的面部填充材料，是人体内丰富的结构性蛋白质，以其卓越的生物相容性、安全性及对组织健康和功能的关键作用而著称。胶原蛋白分为动物来源和重组表达，传统的动物或人体来源的胶原蛋白存在动物源性病原体和免疫反应风险及纯度低、质量不稳定的问题。胶原蛋白的基本结构单元是三条多肽链缠绕形成的三螺旋结构，每条链包含重复的gly-x-y氨基酸序列，这些链在合成过程中通过氢键形成稳定的三螺旋结构，其中gly是甘氨酸，x和y通常为脯氨酸和羟脯氨酸。重组胶原蛋白在具有较高生物相容性与安全性的同时也面临高成本与以及在纯化表达方面的技术挑战，且无法完全模拟天然胶原的作用。

2、透明质酸(ha)作为一种天然的面部填充材料，是由重复的n-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸单元组成的线性多糖，具有高水合性和生物相容性，但易被体内透明质酸酶降解，需频繁补充以维持效果。此外，透明质酸作为面部填充物时，其支撑性较差，影响了长期效果。为解决这些问题，科研人员探索了胶原蛋白与透明质酸的交联技术，以期结合两者的优势。然而，使用化学交联剂如戊二醛，虽然能够有效交联，但可能带来潜在的毒性，导致细胞毒性和炎症反应。而物理交联方法虽能避免化学毒性，但其交联结构通常较弱，导致在体内稳定性差，仍需进一步优化以满足临床需求。为此本发明提出一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物及其制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物，所述重组胶原蛋白具有三螺旋结构，所述透明质酸通过共价键与重组胶原蛋白进行偶联形成复合物。

4、进一步的，所述重组胶原蛋白-透明质酸复合物的结构式如下：

5、

6、进一步的，所述重组胶原蛋白是优化后的重组人源iii型胶原蛋白，使用算法设计和优化筛选来获得重组胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。重组胶原蛋白的分子量选择50～200kda，优选50～150kda，更优选100kda。

7、进一步的，所述重组胶原蛋白-透明质酸复合物的组分包含分子量为700kda的γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid,γ-pga)。

8、重组胶原蛋白的羧基(-cooh)与透明质酸的羟基(-oh)进行酯化反应，而γ-pga作为生物支架材料提供羧基(-cooh)与重组胶原蛋白的胺基(-nh2)进行酰胺化反应交联形成对人体体内的酵素降解具有高抵抗性的酰胺键结(-conh)，从而减缓降解速率。形成具有较佳生物相容性、高稳定性的具有力学性能的重组胶原蛋白-透明质酸复合物，

9、根据上述所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物在制备组织工程材料中的用途。

10、一种根据上述所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物的制备方法，包括以下步骤：

11、步骤1：将重组胶原蛋白溶解于用注射用水配制的10～100mm的mes缓冲液中，将γ-pga加入溶液中，形成第一复合体系；

12、步骤2：将第一复合体系与第一交联剂混合，形成第一交联体系；

13、步骤3：将第一交联体系与第二交联剂混合，得到胶原蛋白-支架交联体系；第二交联剂与第一交联剂不同；

14、步骤4：将透明质酸与胶原蛋白-支架交联体系混合，得到重组胶原蛋白-透明质酸复合物。之后，混合重组胶原蛋白-透明质酸复合物于2-(n-甲基氨基)乙磺酸(mes)缓冲液中。

15、进一步的，生物支架材料可以是戊二酸二甲酯、多聚赖氨酸、壳聚糖、海藻酸盐、γ-pga、聚乙二醇或糖醛酸。优选γ-pga，分子量为700kda。

16、进一步的，透明质酸可以是低分子量透明质酸、中分子量透明质酸、高分子量透明质酸、超高分子量透明质酸、交联透明质酸、水解透明质酸、乙酰化透明质酸或钠透明质酸。透明质酸与重组胶原蛋白交联后，可以形成稳定的三维网络结构，提供更好的机械强度和弹性。低分子量透明质酸在交联过程中可以有效填充胶原蛋白之间的空隙，增强材料的整体稳定性和耐久性，且透明质酸具有良好的缓释性能，低分子量的透明质酸在与胶原蛋白交联后，可以逐步释放有效成分，延长其在皮肤中的作用时间。因此优选低分子量透明质酸，其选择为5～200kda，优选20～100kda，更优选50kda、70kda。

17、进一步的，第一交联剂可以是醛类交联剂、醇类交联剂、亚胺类交联剂或烷类交联剂。选自1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(edc)、1,2-乙烯二胺、4,4’-二氨基二苯醚及戊二酸二甲酯(dms)中的一种或多种。优选edc，体积百分浓度为2～30％。优选5～20％，更优选8～15％。

18、进一步的，第二交联剂可以是醛类交联剂、醇类交联剂、亚胺类交联剂或烷类交联剂。优选为n-羟基-丁二酸亚酰胺(nhs)，nhs与之前步骤所加的edc形成亚胺类交联剂混合物，该亚胺类交联剂混合物的作用为胺基与羧基的酰胺反应。edc与nhs的摩尔比无特别限制，优选1:1、2:1、6:1及5:2，更优选2:1、6:1及5:2，最终选择6:1。于反应浓度商，亦无特别限制，只要能于胶原蛋白分子间及/或分子内进行胺基与羧基的交联反应即可。

19、进一步的，所使用的亚胺类交联剂，其交联反应为胺基与羧基间的共价交联反应，因此，亚胺类交联剂能使胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基进行交联反应。

20、进一步的，所述步骤1中，重组胶原蛋白的浓度为20～40mg/ml。

21、进一步的，所述制备方法的总反应体系的ph为3～6，优选ph为3～4，更优选ph为3、3.5。反应温度为4～30℃，优选4～25℃，更优选18～23℃。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、本发明提供了一种具有三螺旋结构的重组胶原蛋白-透明质酸复合物及其制备方法，旨在解决透明质酸与胶原蛋白作为天然材料易被降解、体内留存时间过短及具有生物毒性等问题。本发明所制备的重组胶原蛋白-透明质酸复合物能显著提升肌肤的水润度、修复受损组织并增强肌肤的自然弹性，该复合物不仅优化了其生物相容性和稳定性，具备优良的力学性能，还显著减缓了体内降解速度，从而延长了其在皮肤中的有效作用时间，适用于医疗美容领域的支撑材料。

1.一种重组胶原蛋白-透明质酸复合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白具有三螺旋结构，所述透明质酸通过共价键与重组胶原蛋白进行偶联形成复合物。

2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白是优化后的重组人源iii型胶原蛋白，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白-透明质酸复合物的组分包含分子量为700kda的γ-pga。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物在制备组织工程材料中的用途。

5.一种根据权利要求1～3任一所述的重组胶原蛋白-透明质酸复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，重组胶原蛋白的浓度为20～40mg/ml。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的总反应体系的ph为3～6，反应温度为4～30℃。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第二交联剂为n-羟基-丁二酸亚酰胺，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺与n-羟基-丁二酸亚酰胺的摩尔比为6:1。