一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法

本发明涉及动物生物，具体为一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法。

背景技术：

1、黄颡鱼作为一种淡水名特优水产养殖品种，经济价值高，且养殖规模和养殖密度逐年上升，涉及到的相关研究逐渐增多，是一种优质的淡水鱼类研究模型，乳糜微粒作为富含甘油三酯的脂蛋白颗粒，其组装和分泌只发生于肠上皮细胞内，是膳食中的脂质吸收进入淋巴循环进而进入血液循环的唯一方式。介于乳糜微粒是脂质吸收转运的唯一载体，其正常的合成与转运是平衡肠道脂质代谢的基础。乳糜微粒的功能失衡会导致高甘油三脂血症，并进而引发各种健康疾病，同时，它也是引发代谢综合征的一个潜在因素。

2、作为研究乳糜微粒合成转运机制的基础，探寻从细胞中分离出高纯度的乳糜微粒的方法不可或缺。目前国内外提取乳糜微粒的方法成熟，主要运用是密度梯度超速离心法，并且相关的提取方法主要集中于哺乳动物，关于鱼类相关乳糜微粒的提取方法所公开发表的专利和论文相对较少。

3、此外，鱼类所生活的环境与哺乳动物差别较大，细胞所处于的渗透压与其大小都具备显著差异，并且大多数只涉及了血液中乳糜微粒的提取，因此，现存的提取方法在鱼类组织上不适用，为进一步探究乳糜微粒在黄颡鱼肠道脂质代谢中的作用机制，就迫切需要建立一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法来解决上述中提出的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，具备提取效果好等优点，解决了现存的提取方法在鱼类组织上不适用的问题。

2、为实现上述提取效果好目的，本发明提供如下技术方案：一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，包括以下：

3、1)前期制备：选取适中的黄颡鱼，准备含bsa(牛血清白蛋白)的hank’s溶液、胶原蛋白酶、胰蛋白酶和pmsf(蛋白酶抑制剂)试剂；

4、2)处理黄颡鱼：选取适中的黄颡鱼剪鳃、放血、取肠，肠道先在含bsa的hank’s中清洗2-3次，将洗涤后的肠道加入hank’s，清洗3-4次以去除肠腔杂质，剪碎后捞出；

5、3)消化处理：根据肠道含量用等体积消化液(胶原蛋白酶与胰蛋白酶2：1混合)进行消化；

6、4)制备匀桨液：按每克组织加入2ml的hank’s，并加入适量pmsf蛋白酶抑制剂后，缓慢轻柔匀浆，直至没有组织结块为止，研磨后500g离心5min去除粗提杂质；

7、5)离心处理：破碎后的匀浆液850g离心10min，去沉淀，留上清液，上清液再按3)中的条件离心两次，基本去除未破碎的细胞及细胞碎片；离心过程中，使用nac l溶液调节上清液密度为1.00g/ml-1.20g/ml；

8、6)收集乳糜微粒：在2ml匀浆液上依次覆盖4ml浓度为1.063g/ml的nac l密度溶液、4ml浓度为1.019g/ml的nac l密度溶液和2.5ml浓度为1.006g/ml的nac l密度溶液，收集上层液面2.5m l体积的液体，收集完成后，得到乳糜微粒。

9、进一步，所述1)中的bsa浓度为3％，所述1)中必要的实验设备包括离心机和研磨机。

10、进一步，所述2)中添加胶原蛋白酶与胰蛋白酶进行鱼肝消化反应的消化时间为每次消化5-8分钟，消化次数为3-4次。

11、进一步，所述3)在匀浆前对组织块进行消化，以减少细胞之间的偶联介质。

12、进一步，所述4)经多次实验，挑选最优低速离心力850g，离心处理12min去除未破碎的细胞。

13、进一步，所述5)中上清液的密度为1.10g/m l。

14、进一步，所述6)中匀浆液的收集温度为4℃，所述6)中匀浆液的收集时间为1.5小时。

15、与现有技术相比，本发明提供了一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，具备以下有益效果：

16、1、该高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，本发明首次提出一种淡水鱼类肠道乳糜微粒的提取技术，通过采用上述六个提取乳糜微粒操作简单易行，提取效率高，通过利用组织提取的乳糜微粒杂质少，通过采用组合消化液消化组织间杂质，能够有效减少污染，提高细胞提取效率，达到了提取效果好的优点。

17、2、该高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，根据鱼类肠道细胞特点，通过进行多次差速离心以充分去除现有方法中存在的细胞碎片问题，利用差速离心中多次的重悬以减少胞浆污染，并且不断扩大重悬比例以稀释所包含的杂质，提高纯度，达到了提取效果好的优点，解决了现存的提取方法在鱼类组织上不适用的问题。

1.一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于，包括以下：

2.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述1)中的bsa浓度为3％，所述1)中必要的实验设备包括离心机和研磨机。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述2)中添加胶原蛋白酶与胰蛋白酶进行鱼肝消化反应的消化时间为每次消化5-8分钟，消化次数为3-4次。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述3)在匀浆前对组织块进行消化，以减少细胞之间的偶联介质。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述4)经多次实验，挑选最优低速离心力850g，离心处理12min去除未破碎的细胞。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述5)中上清液的密度为1.10g/ml。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度的黄颡鱼肠道乳糜微粒提取方法，其特征在于：所述6)中匀浆液的收集温度为4℃，所述6)中匀浆液的收集时间为1.5小时。