PpL在抑制革兰阴性菌生物膜形成上的应用、抑制剂及六聚改造体的制备方法与流程

本发明涉及生物领域，具体涉及ppl在抑制革兰阴性菌生物膜形成上的应用、抑制剂及六聚改造体的制备方法。

背景技术：

1、目前，细菌抗生素耐药性是对人类构成最严重的公共卫生威胁之一。据估计，如果没有好的解决办法，到2050年每年因多重耐药(mdr)细菌感染导致的死亡人数可能超过1000万，超过心脏病和癌症造成的死亡人数总和。多重耐药(mdr)微生物的出现是耐药基因广泛传播的综合结果，主要是由于抗生素的过度使用以及耐药基因在各种细菌物种之间的交换。当微生物形成生物膜时，这个问题变得更加可怕，因为生物膜的形成可以将细菌耐药性放大多达1000倍，从而增加mdr感染的发生率。因此，抑制细菌生物膜是解决细菌抗菌素耐药性的关键。

2、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属是众所周知耐药最严重的的革兰氏阴性菌。这些微生物采用“群体感应(qs)”系统，即一种细胞间通讯机制，来调节种群密度，并调节与耐药性和致病行为相关的基因的表达。其中一种行为是生物膜的形成，这是一种保护机制，可以保护细菌免受不利条件的影响。酰化高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones，ahls)是这些细菌分泌的主要群体感应信号分子。大量研究表明，群体感应在调节生物膜形成过程中起着关键作用，引入外源性ahls可以显着影响生物膜特性，包括生物膜的厚度和持续时间。例如，在世界卫生组织(who)发布的全球优先病原体(gpp)清单上，被归类为关键优先病原体的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌都依赖于基于ahls的生物膜形成和毒力因子的产生机制。在鲍曼不动杆菌中，产生和利用的主要ahls是n-十二烷酰基-l-高丝氨酸内酯(c12-hsl)和3-羟基-c12-hsl，而c4-hsl和3-氧代-c12-hsl是铜绿假单胞菌中产生的主要ahls。这些ahls在细菌物种中协调生物膜形成和毒力因子的表达中起着至关重要的作用。

3、n-酰基-l-高丝氨酸内酯酶(ahlase)是一种群体淬灭(qq)内酯酶，其破坏依赖ahls信号转导的细菌行为。这些酶促进内酯环的水解，生成n-酰基-l-高丝氨酸和质子(h+)。这类酶已被证明能够抑制革兰氏阴性菌中生物膜的形成和毒力因子的分泌，使其成为抗菌策略的有力候选者。n-酰基-l-高丝氨酸内酯酶在耐多药(mdr)铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中表现出减少生物膜形成和增加对多种抗生素敏感性的能力。因此，这些酶有可能将耐药菌株从耐药状态转变为中间或敏感状态。

4、基于群体感应机制，群体淬灭作为一种有效的生物控制策略而备受重视。据报道，如aiia、aiib、aidc、moml、gcl]和aal[，可有效破坏基于ahls的信号传导。然而，这些酶通常存在诸如酶催化活性低或热稳定性不足等局限性，这极大阻碍它们的广泛应用。因此，发现兼具高催化活性和优异热稳定性的ahlase，或将现有的ahlase改造提高其热稳定性对于有效的群体淬灭策略至关重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供ppl在抑制革兰阴性菌生物膜形成上的应用、抑制剂及六聚改造体的制备方法。目的是提供稳定且高效的抑制革兰阴性菌生物膜形成的ppl和抑制剂，同时对其他非六聚体的酰基高丝氨酸内酯酶进行改造。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，ppl在抑制革兰阴性菌生物膜形成上的应用。

4、本发明的有益效果是：本发明的ppl具有更高的热稳定性，且表现出对革兰阴性杆菌，尤其是鲍曼不动杆菌，具有生物膜抑制作用；因此，ppl解决了现有的ahlases的催化效率和热稳定性相对比较差的问题，并促进了其在各个领域的更广泛应用，对于有效的群体淬灭策略具有至关重要的作用。

5、ppl(wp_082630345)是一种由306个氨基酸组成的内酯酶，分子量为34.7kda；它最初是从草假单胞菌中分离出来。值得注意的是，ppl的氨基酸序列具有独特的基序“107hxhxdh112-h196-d217-h263-”，该基序通常与金属-β-内酰胺酶(mlls)相关。

6、本发明上述进一步的有益效果是：ppl是一种来自草假单胞菌的n-酰基-l-高丝氨酸内酯酶家族蛋白，本发明对ppl进行了全面表征，研究表明ppl具有卓越的催化活性和热稳定性；ppl被证实是同源六聚体的酰基高丝氨酸内酯(ahl)酶，其桶状结构对其较高的热稳定性和强大的酶活性至关重要。

7、进一步，所述ppl通过降解酰基高丝氨酸内酯来抑制革兰阴性菌生物膜形成。

8、进一步，所述革兰阴性菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和肠杆菌中的任意一种或至少两种的组合。

9、进一步，所述ppl结构为具有桶状的六聚体。

10、第二方面，一种抑制革兰阴性菌生物膜形成的抑制剂，所述的抑制剂包括ppl。

11、进一步，所述的抑制剂还包括药物学上可接受的载体和/或辅料。

12、其中，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。

13、进一步，所述的抑制剂的剂型为药学上可接受的任意剂型，所述药物剂型为口服剂型(例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂等)或注射剂型。

14、另外，所述的抑制剂中的活性成分(本发明的六聚体的酰基高丝氨酸内酯酶)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。所述的抑制剂的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。

15、第三方面，本发明还提供了酰基高丝氨酸内酯酶的六聚改造体的制备方法，包括如下步骤：将酰基高丝氨酸内酯酶中参与亚基间互作的氨基酸序列替换成ppl中参与亚基间互作的氨基酸序列。

16、将其他非六聚体ahlase中参与亚基间互作的氨基酸序列替换成ppl中参与亚基间互作的氨基酸序列，将非六聚体ahlase六聚化，得到六聚体的酰基高丝氨酸内酯酶改造体，也具有强热稳定性。

17、进一步，所述酰基高丝氨酸内酯酶的六聚改造体的制备方法，包括如下步骤：将酰基高丝氨酸内酯酶中参与亚基间互作的氨基酸序列替换成ppl中参与亚基间互作的氨基酸序列，所述ppl中参与亚基间互作的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的位于ppl氨基酸序列26-41位的序列，如seq id no.2所示的位于ppl氨基酸序列140-153位的序列，和如seqid no.3所示的位于ppl氨基酸序列226-239位的序列。

18、第四方面，本发明还提供了酰基高丝氨酸内酯酶的六聚改造体，采用如上述的方法制备得到。

19、进一步，所述酰基高丝氨酸内酯酶的六聚改造体包括如seq id no.4或seq idno.5所示。

20、seq id no.4(aal改造体)：

21、mtniakaqpklyvmdngrmrmakdffggagifsnsgtiefpiytvlidhpegkilfdts

22、cnpdsmgaqgrwgeatqsmfpwtaseecylhnrleqlkvrpedikfviashlhldha

23、gclemftnatiivhedefsgalqtyarnheteeekewvgayiwgdidawiknnlnwrt

24、ikrdednivlaegikilnfgsghawgmlglhvqlpekggiilasdavysaesygmwppgyhqgdslgfvrsvekikriaketnsevwfghdseqfkrfrkstegyye；

25、seq id no.5(aiib改造体)mgnklfvldlgeirvakdffggagifsnsgtidipvsayliqctdatvlydtgchpecmgtngrwpaqsqlnapyigasecnlperlrqlglspddistvvlshlhndhagcveyfgksrliahedefatavryfaheteeekewvspyivkdieawlatprnwdlvgrdererelapgvnllnfgtghasgmlglavrlekqpgfllvsdacytatnygppmwppgyhqgdtigydrtvshirqyaesrsltvlfghdreqfaslikstdgfye。