一种脱细胞基质水凝胶改性骨支架及其制备方法与应用

本发明涉及医用材料，尤其涉及一种脱细胞基质水凝胶改性骨支架及其制备方法与应用。

背景技术：

1、肿瘤、外伤、先天发育缺陷、骨髓炎、牙周炎和牙缺失等疾病高发，它们通常并发骨缺损。颌面部骨缺损会影响义齿的固位、稳定和功能行使，而且危害到患者外貌、咀嚼、语言等口颌复合功能重建；长骨缺损会影响肢体的运动功能和负重能力。骨缺损对患者的日常社交活动、生活质量和心理健康造成极大干扰。目前，临床上常用骨替代材料治疗骨缺损，其中骨支架材料因具有良好的成骨空间支持性和稳定性而更易实现骨再生。

2、当今社会对骨再生治疗需求愈来愈高。一方面，随着人口老龄化的加剧，骨缺损的发生率和治疗难度上升，对有效治疗方法的需求也日益增加。另一方面，随着口腔种植学和修复学等学科的发展和生活水平的提升，人们对骨缺损修复的质与量均提出了更高的要求。骨再生可以从头形成完美的组织器官，是一个复杂的多阶段过程，涉及连续的细胞事件、多个系统的协同作用，包括细胞之间、细胞与其微环境之间的紧密协作，以及多能性谱系分化过程中的时空顺序演化。颅骨发育过程中，颅颌面神经嵴细胞需要在细胞外基质的介导下经历迁徙、凝聚、分化、基质分泌和改建矿化等阶段，为骨的完全再生提供了理想的演变框架。研发具有诱导真正意义上的骨组织再生的骨支架成为下一阶段骨替代材料的发展目标。

3、“骨发育回归”的理念是根据胚胎幼体骨生长发育原理，模拟或重现骨生长发育过程而促进器官再生，是极具潜力的再生医学新方向。在成体的组织再生过程中，通过构建复杂的生长发育信号网络模拟组织生长发育期的特殊微环境，仿照生长发育给予成体干细胞间充质凝聚、上皮-间充质互作等关键信号，诱导骨损伤组织沿用发育时期的模式(骨发育回归)，实现完整组织结构的再生。

4、“促骨发育回归”的改性骨支架，需要满足携带丰富骨生长发育期信号，通过激活wnt、fgf、bmp和tgf-β等特有的生长发育信号通路，诱导slug、runx 2、soc9、cxcl12、sox9、twist1基因表达，启动上皮间充质转化、神经嵴细胞的生成和迁移、成骨细胞的成熟等骨发育程序性事件启动，并促进软骨形成重要基因的表达，重构特殊的骨生长发育微环境，实现生长发育时的关键发育程序性事件重现。

5、现有的骨替代材料往往只关注材料的物理支撑性，忽略了生长发育期关键生物信号的重要性，因而无法实现“骨发育回归”的骨再生。因此，研究具有促骨发育回归功能的骨替代材料成为骨再生领域的研究前沿。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种脱细胞基质水凝胶改性骨支架，通过骨支架表面引入脱细胞基质水凝胶制备，可诱导干细胞发育回归从而促进骨再生，匹配不同骨缺损区域的需求。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种脱细胞基质水凝胶改性骨支架，所述脱细胞基质水凝胶改性骨支架由脱细胞基质水凝胶和骨支架原位交联而成；所述脱细胞基质水凝胶由胚胎期或生长发育期的组织器官制备得到；所述骨支架包括自体骨、异种骨和合成材料中的至少一种。

4、骨再生是一个复杂的多阶段过程，涉及连续的细胞事件、多个系统的协同作用，包括细胞之间、细胞与其微环境之间的紧密协作，以及多能性谱系分化过程中的时空顺序演化。为了在既往研究的基础上增强骨再生的效果、提高成骨的质量，实现完全的骨再生，可以以颅骨发育作为骨再生的框架，对上述多因素进行综合而精密的调控，促进成体骨再生以类似骨发育的模式进行，实现骨发育回归。本发明制备出了一种脱细胞基质水凝胶改性骨支架，其中，骨支架能够为骨缺损处提供机械支持并提供骨生长的支架，促进骨细胞附着和增殖，诱导新骨形成。细胞外基质是由细胞分泌并存在于细胞周围的细胞基质成分，是细胞与细胞、细胞与微环境交互过程中不可逾越的介质；它不仅为细胞提供物理支撑和与外界的交互介质，还参与了多种细胞内、细胞间和细胞与微环境间的信号传导等细胞活动，综合塑造了胚胎期骨发育微环境。本发明在骨支架表面引入脱细胞基质水凝胶以制备具有诱导干细胞发育回归功能的胚胎期或生长发育期脱细胞基质水凝胶改性骨支架。利用动物体特定的细胞外基质重塑干细胞和生物微环境，诱导干细胞发育回归，进而通过发育回归后的干细胞强劲的促成骨能力实现骨再发育，治疗成年个体骨缺损再生。

5、优选地，本发明通过物理冻干法进行原位交联。

6、优选地，所述组织器官为动物来源。

7、优选地，所述组织器官包括骨组织、软组织。

8、更优选地，所述骨组织包括颅骨组织。

9、优选地，所述自体骨、异种骨均为动物来源的骨组织；所述合成材料包括生物玻璃、磷酸钙、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。

10、优选地，所述自体骨为同一个体所获得的骨组织，包括但不限于下颌联合、下颌支、外斜嵴、髂嵴、尺骨近端或桡骨远端等来源的皮质骨块、皮质松质骨块、皮质骨颗粒、松质骨颗粒和骨屑；所述异体骨包括同种异体骨；所述同种异体骨为相容的活体供体或尸体骨来源得到的各种形式骨组织；所述异种骨的来源包括但不限于猪骨、牛骨、羊骨。

11、优选地，所述生物玻璃包括但不限于二氧化硅生物玻璃、硼酸盐生物玻璃。

12、优选地，所述磷酸钙包括羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸二钙。

13、优选地，所述动物来源包括但不限于大鼠、小鼠、猪、羊、牛、马。

14、更优选地，所述骨支架为猪骨源性生物钙磷灰石支架。

15、第二方面，本发明提供了上述脱细胞基质水凝胶改性骨支架的制备方法，包括如下步骤：

16、(1)取动物来源的骨组织，去除多余组织，脱脂，洗涤、干燥、煅烧处理得到骨支架；或取合成材料经化学处理得到骨支架；

17、(2)取胚胎期或生长发育期的组织器官，经脱细胞处理和基质消化，得到脱细胞基质水凝胶原液；

18、(3)将步骤(2)得到的脱细胞基质水凝胶原液与步骤(1)得到的骨支架混合，通过原位交联，冷冻，干燥，得到所述脱细胞基质水凝胶改性骨支架。

19、优选地，所述步骤(1)中，脱脂方法为先加入过氧化氢溶液浸泡，再加入无水乙醇浸泡。

20、优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为10％～30％，浸泡时间24h。

21、优选地，所述无水乙醇浸泡时间为24h。

22、优选地，所述煅烧前进行切块处理。

23、优选地，所述切块处理为：将骨组织切成圆柱体，厚度1mm，横截面直径5mm。

24、优选地，所述煅烧的条件为：温度400-1000℃，时间为2-6h。

25、优选地，所述步骤(2)中，组织器官为发育期第15天的鼠胚胎。

26、优选地，所述步骤(2)中，脱细胞处理方法包括物理方法、化学方法、酶解法中的至少一种。

27、优选地，所述物理方法包括但不限于反复冻融、超声处理、高静水压力；所述化学方法包括但不限于使用sds和triton-100、丙酮、甲醇、乙酸、氢氧化钠、乙醇处理；所述酶解方法包括但不限于使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、核酸内切酶和外切酶处理。

28、优选地，所述脱细胞方法为：先用含有1％ triton-100(w/w)的pbs溶液浸泡24h，再用含有1％ sds(w/w)的pbs溶液浸泡为48h。

29、优选地，所述步骤(2)中，基质消化的方法为采用酶进行消化。

30、优选地，所述酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、上皮分离酶、胶原酶中的至少一种。

31、优选地，所述消化方法为：用含有1mg/ml胃蛋白酶(3000-3500nfu/g)的0.01m盐酸溶液浸泡2周。

32、优选地，所述步骤(2)中，基质消化后需要加入碱液调节ph至7.0，终止消化。

33、优选地，所述碱液包括naoh溶液、na2co3溶液、氨水。

34、优选地，所述步骤(3)中，混合的方式为将脱细胞基质水凝胶原液滴加在骨支架上。

35、优选地，脱细胞基质水凝胶原液滴加的体积根据材料大小选择，以原液能够覆盖材料为准。

36、优选地，所述步骤(3)中，原位交联的方法包括但不限于：

37、(1)通过水凝胶中引入交联剂或交联化合物，使其发生化学交联；常用的交联剂包括羧甲基纤维素(cmc)、环氧化合物、聚乙二醇(peg)、巯基化合物；

38、(2)利用温度的变化来引发水凝胶交联反应的热交联，使用高温或低温处理水凝胶样品；

39、(3)在水凝胶中引入光敏剂或光引发剂，利用特定波长的光照射来引发水凝胶中交联反应的光交联反应；

40、(4)利用生物分子(如酶或细胞)来实现水凝胶交联的生物学交联法。

41、第三方面，本发明提供了上述脱细胞基质水凝胶改性骨支架在制备骨修复或骨再生材料中的应用。

42、优选地，所述脱细胞基质水凝胶改性骨支架通过诱导骨发育期微环境和干细胞发育回归促进骨修复或骨再生。

43、本发明的有益效果为：

44、本发明所述脱细胞基质水凝胶改性骨支架的制备原料简单易得，骨支架具有良好的机械强度以支撑脱细胞基质，并具有良好的骨传导性能，其具有的三维立体结构特征有利于细胞的迁移、黏附和生长，进而为组织修复再生提供理化结构和生物学信号。本发明在现有的骨支架表面滴加脱细胞基质水凝胶原液，通过物理冷冻干燥等方法原位交联即可得到脱细胞基质水凝胶改性骨支架，制备技术简单，成本低廉，适用于大批量生产。此外，骨支架表面负载的脱细胞基质水凝胶能够实现脂质体或其他纳米药物载体的负载，实现药物在骨缺损部位的精准释放与治疗。本发明所述脱细胞基质水凝胶改性骨支架通过在成年个体骨缺损内塑造骨发育微环境诱导干细胞发育回归，促进骨再生和成骨质量，提升了骨支架的骨缺损再生治疗效果。

45、本发明所述的脱细胞基质水凝胶为动物来源，生物相容性良好，保留了细胞外基质中胶原蛋白、非胶原蛋白、蛋白聚糖、生长因子和基质囊泡等主要成分，类似于天然细胞外基质，可明显减轻炎症和异物反应带来的组织损伤和愈合障碍。

46、本发明所制备的脱细胞基质水凝胶改性骨支架保留了原有骨支架的优良性能和三维立体结构，将其植入机体后可以匹配不同骨缺损区域的需求，在诱导干细发育回归的同时，还具有良好的生物活性、无细胞毒性以及低免疫原性，易于机体降解和吸收，具有较好的应用前景。

47、本发明基于“骨发育回归”理念研发新型“促骨发育回归”的改性骨支架，对骨组织再生领域具有重大意义。