一种具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法与流程

本发明属于生物医药，尤其涉及一种具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法。

背景技术：

1、壳聚糖(chitosan)是天然的阳离子碱性氨基多糖，含有丰富的氨基和羟基，具有良好的生物活性、安全无毒、低成本、可生物降解等特点，为引入活性功能物质及构建刺激响应型生物材料提供了可能。此外，壳聚糖还具有广谱抗菌性，对细菌、真菌等多种微生物均具有明显的抑制作用，其抗菌机制主要包括破坏细胞膜通透性、影响细菌细胞磷脂和蛋白质合成、螯合金属离子等。

2、柠檬醛(citral)又名3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛，分子式为c10h16o，无色或淡黄色液体，有柠檬香气，无旋光性，有两种顺反异构体，分别为香叶醛和橙花醛，含量比例约为2∶3。柠檬醛广泛存在于山苍子、柠檬草、丁番罗勒等植物中，在我国通常是从山苍子中提取天然柠檬醛，山苍子精油中柠檬醛含量最高，可达到85％。柠檬醛具有抑菌、消炎等功能，对细菌、真菌的生长繁殖有很好的抑制作用。近年来，越来越多的研究利用包埋技术将柠檬醛制备成缓释制剂，这种制剂可以提高柠檬醛的稳定性，保护柠檬醛不受外界环境的影响，同时能起到缓释的作用，延长作用时间，对拓宽柠檬醛的应用范围意义重大。

3、单宁酸(tannin acid)含有丰富邻苯二酚基团和邻苯二酚衍生物，能抑制细菌、真菌、酵母及革兰氏阳性/阴性细菌等多种微生物的生长，邻苯二酚基团中含有大量的羟基，可产生各种强相互作用而拥有超强黏附力。

4、锌盐具有广谱、安全、不易产生耐药性以及持久性等优势，具有广谱、安全、不易产生耐药性以及持久性等优势。此外，锌纳米粒子也易与壳聚糖上的氨基和羟基易形成络合物，锌纳米粒子还可以作为动物锌营养补充剂，提高动物免疫力。

5、天然柠檬醛作为天然抗菌材料，具有巨大的应用潜力和推广价值，然而，柠檬醛不稳定、易分解且不溶于水，这限制了其应用范围。其衍生物及生物活性受到科学家的广泛关注，为开发新型生物医药代替抗生素开辟新途径，但有关壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌复合物的抑菌研究还比较少。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，以壳聚糖、柠檬醛、单宁酸和锌盐作为主要原料，利用席夫碱和络合反应，采用超临界高压隔氧均质，制备以提高柠檬醛的稳定性和抑弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒，达到扩大其应用领域的目的。

2、为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，以壳聚糖、柠檬醛、单宁酸和锌盐为原料，利用席夫碱反应和络合反应，采用超临界高压均质，制备获得具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒。

4、进一步地，所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)将柠檬醛溶液缓慢滴加到含酸的壳聚糖分散液中，在40～60℃恒温条件下搅拌，直至体系分散液颜色由白色加深至稳定的黄色即得到壳聚糖-柠檬醛分散液；

6、(2)将含纳米锌的锌盐分散液缓慢滴加至单宁酸分散液中，缓慢搅拌制备获得单宁酸-锌分散液；

7、(3)将上述步骤(2)获得的单宁酸-锌分散液缓慢滴加到由步骤(1)获得的壳聚糖-柠檬醛分散液中，在40～60℃恒温条件下搅拌，通过超临界高压均质1h。由于壳聚糖和单宁酸是大分子物质，不易分散，使用高速剪切以达到微粒分散均匀的目的。待体系稳定后，冷冻干燥，即得到壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒。

8、进一步地，步骤(1)中，柠檬醛溶液中所含的柠檬醛质量百分比为1％～5％，所用溶剂为乙醇；含酸的壳聚糖分散液中所含壳聚糖的质量百分比为10％～30％，所用溶剂为乙醇，所含的酸为乙酸，乙酸的质量百分比为1％～2％。

9、进一步地，步骤(1)中，柠檬醛溶液与含酸的壳聚糖分散液用量比为体积比为1:1～1:5。

10、进一步地，步骤(2)中，含纳米锌的锌盐分散液所含的锌盐为乙酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌和氯化锌中的任一种，锌盐中所含锌纳米粒子占锌盐与单宁酸混合物总质量百分比的1wt％～5wt％，所用溶剂为乙醇。

11、进一步地，含纳米锌的锌盐分散液与单宁酸分散液用量比为1：1～5：1。

12、进一步地，步骤(3)中，单宁酸-锌分散液与壳聚糖-柠檬醛分散液的用量比为1:2～1:10。

13、进一步地，步骤(3)中，超临界co2萃取仪设置的条件为：co2 heater45℃～50℃、mmv heater 100℃、vessel heater 45℃～50℃、co2 pump pressure250～300bar。

14、进一步地，上述任一所述方法制备得到的具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒。

15、进一步地，所述的具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒，柠檬醛释放率为51.17％，最小抑菌浓度中的柠檬醛的含量低于20μg/ml。

16、相比于现有技术，本发明的优点如下：

17、1)本发明以环境友好、可生物降解的壳聚糖(cs)、柠檬醛(ct)和单宁酸(ta)以及广谱、安全不易产生耐药性的锌盐作为主要原料，在制备cs-ct席夫碱的基础上，采用超临界co2萃取分离技术给缓释制剂的制备提供一个高压、低温且隔氧的环境，防止柠檬醛在反应过程中因高温、氧化变性，将cs-ct和ta-zn高压均质，实现提高抑菌成分-柠檬醛的稳定性，保护抑菌成分-柠檬醛不受外界环境的影响，同时能起到缓释的作用。

18、2)本发明可通过酸性溶液体系触发裂解释放出柠檬醛，能有效保证柠檬醛的稳定性，并且保持柠檬醛原始的功能活性，能够满足科研相关生物活性实验要求，所用原料也符合中国食品添加剂原料要求，所用溶剂均为低毒溶剂，制备方法简单，工艺稳定性好，可应用于食品、医药等领域。此外，本发明在ph1.5条件下随时间变化呈现释放差异，可根据实际需要来调控活性物质的释放以抑菌。

19、3)本发明所制备的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌复合物的柠檬醛释放率为51.17％，最小抑菌浓度中的柠檬醛的含量在20μg/ml左右，其抑菌效果远优于柠檬醛单体在抑制副溶血性弧菌的最小抑菌浓度100μg/ml。

20、4)本发明制成的复合物具有良好的抑弧菌活性，可开发成为食品或饲料添加剂、抗菌剂等；且本复合物具有丰富的锌含量，也可以作为动物锌营养补充剂，提高动物免疫力等应用。

1.一种具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，以壳聚糖、柠檬醛、单宁酸和锌盐为原料，利用席夫碱反应和络合反应，采用超临界高压均质，制备获得具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒。

2.根据权利要求1所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，柠檬醛溶液中所含的柠檬醛质量百分比为1％～5％，所用溶剂为乙醇；含酸的壳聚糖分散液中所含壳聚糖的质量百分比为10％～30％，所用溶剂为乙醇，所含的酸为乙酸，乙酸的质量百分比为1％～2％。

4.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，柠檬醛溶液与含酸的壳聚糖分散液用量体积比为1:1～1：5。

5.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，含纳米锌的锌盐分散液所含的锌盐为乙酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌和氯化锌中的任一种，锌盐中所含锌纳米粒子占锌盐与单宁酸混合物总质量百分比的1wt％～5wt％，所用溶剂为乙醇。

6.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，含纳米锌的锌盐分散液与单宁酸分散液用量比为1：1～5：1。

7.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，单宁酸-锌分散液与壳聚糖-柠檬醛分散液的用量比1：2～1：10。

8.根据权利要求2所述具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，超临界co2萃取仪设置的条件为：co2heater 45℃～50℃、mmvheater 100℃、vessel heater 45℃～50℃、co2 pump pressure 250～300bar。

9.权利要求1～8任一所述方法制备得到的具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒。

10.根据权利要求9所述的具有抗弧菌活性的壳聚糖-柠檬醛-单宁酸锌微粒，柠檬醛释放率为51.17％，最小抑菌浓度中的柠檬醛的含量低于20μg/ml。