一种脱细胞基质温敏凝胶及制备方法和应用与流程

本发明属于医用生物材料，涉及一种脱细胞基质温敏凝胶及制备方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、脱细胞基质温敏凝胶是一种温度敏感的凝胶系统，利用胶原蛋白的自组装能力，其物理状态可以由温度的变化而调控。一般情况下，脱细胞基质温敏凝胶在低于34℃时为粘稠液体，而在体温范围(34～40℃)，原位凝胶就会形成。可自由加载各种不同性质的药物，以溶液形式给药后，在外界温度刺激下可以在用药部位发生溶胶-凝胶的相转变，形成的凝胶可很好的释放药物。

3、植入式温敏凝胶必须进行灭菌，常见灭菌技术有化学灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐照灭菌、过滤除菌等。然而，由于脱细胞基质温敏凝胶对热敏感，现有技术(例如cn2022101942541)优先采用无菌加工或过滤除菌，但是成本高，风险高，不利于扩大化生产；并且制备的胶原蛋白凝胶为液态，只能储存于0-10℃条件下，储存条件受限。辐射灭菌是利用γ射线、能量低于5mev的x射线或10mev以下电子束杀灭微生物的过程。目前的辐射灭菌多采用60co源放射出的γ射线。辐照灭菌与其他灭菌方法相比具有以下优点：穿透力强、灭菌效果不受温度和压力的影响、灭菌性能稳定、无化学残留。

4、据发明人研究了解，目前尚未有脱细胞基质温敏凝胶制备采用辐照灭菌的方式进行灭菌的，因为尽管采用辐照灭菌可使脱细胞基质温敏凝胶sal≤10-6，但是液态的脱细胞基质温敏凝胶经辐照后，引起水分子的电离和激发，产生氧化活性很强的羟自由基、水合电子和氢原子等反应性很高的自由基，这些自由基会对蛋白质产生多种损伤、破坏化学键，可引起胶原蛋白质分子发生交联、聚合、肽链断裂，使得脱细胞基质温敏凝胶固液分离为不均一溶液。最终影响脱细胞基质温敏凝胶温敏性能，即注射到使用部位后在生理温度下原位凝胶不会形成。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种脱细胞基质温敏凝胶及制备方法和应用，能有效保护脱细胞基质温敏凝胶的温敏性能，确保其注射到体内可以固化形成原位凝胶；同时，本发明还能增强脱细胞基质凝胶的强度，有效缩短固化时间，为组织修复提供足够的时间，减少临床手术操作次数。实现了常温储存，运营成本低，实现了工业化生产。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、一方面，一种脱细胞基质冻干纤维的制备方法，按照没食子酸或单宁酸与脱细胞基质的质量比为0.01～0.2:1的比例，将没食子酸或单宁酸加入至脱细胞基质原液中，进行一次交联反应；将一次交联后的物料进行冷冻干燥；采用8～15kgy的辐照剂量对冷冻干燥后的物料进行辐照灭菌；将辐照灭菌后的物料进行热交联，即得；

4、其中，热交联时间不超过60h。

5、另一方面，一种脱细胞基质冻干纤维，由上述制备方法获得。

6、第三方面，一种脱细胞基质温敏凝胶的制备方法，按照每毫升无菌溶剂添加5～50mg的上述脱细胞基质冻干纤维的比例，将所述脱细胞基质冻干纤维与所述无菌溶剂进行混合，即得。

7、第四方面，一种脱细胞基质温敏凝胶，包括上述脱细胞基质冻干纤维与无菌溶剂，所述脱细胞基质冻干纤维与无菌溶剂的比例为5～50:1，mg/ml。

8、第五方面，一种上述脱细胞基质温敏凝胶作为载体在制备药物中的应用。

9、本发明的有益效果为：

10、(1)由于辐照灭菌会使脱细胞基质温敏凝胶胶原蛋白分子内肽键断裂以及分子间交联，导致胶原蛋白的二级结构、三级结构、四级结构发生变化，从而造成胶原蛋白自组装能力降低，因此本发明在温敏凝胶中添加没食子酸或单宁酸为辐照保护剂，在对应的辐照剂量和质量比下，胶原蛋白特征条带能清晰显现，说明产品中胶原蛋白的a1链和a2链没有被破坏，三螺旋结构得以被保护。且没食子酸天然无毒，可以极大的简化脱细胞基质冻干纤维洗脱交联剂的过程，提高制备效率，降低洗脱成本。

11、(2)现有技术常用先热交联，最后进行辐照灭菌，而本发明先辐照灭菌再热交联，极大的提高了脱细胞基质温敏凝胶的温敏特性，有效缩短了固化时间，增强了脱细胞基质温敏凝胶的强度。

12、(3)本发明提供的脱细胞基质温敏凝胶产品实现了灭菌采用辐照灭菌，相比于无菌加工或无菌过滤灭菌方式，提供的冻干工艺、辐照灭菌、交联工艺和制备方法简单可行，生产条件温和，无需进行无菌加工和百级环境控制，重现性好，可控性强，适合大规模工业化生产。得到了一种在辐照过程中能有效保护的脱细胞基质温敏凝胶，确保其注射到使用部位(34～40℃)可以固化形成原位凝胶。

13、(4)本发明利用脱细胞基质温敏凝胶的温敏特性可以实现常温条件下注射，可快速填充不规则形状空间，生理温度迅速固化(10min以内)，提高临床操作的可行性，缩短手术时间，可固化的特点可以实现凝胶在病变部位的留存。

14、(5)本发明将脱细胞基质冻干纤维与溶剂分开包装，打破了脱细胞基质温敏凝胶的低温保存的局限性。

1.一种脱细胞基质冻干纤维的制备方法，其特征是，按照没食子酸或单宁酸与脱细胞基质的质量比为0.01～0.2:1的比例，将没食子酸或单宁酸加入至脱细胞基质原液中，进行一次交联反应；将一次交联后的物料进行冷冻干燥；采用8～15kgy的辐照剂量对冷冻干燥后的物料进行辐照灭菌；将辐照灭菌后的物料进行热交联，即得；

2.如权利要求1所述的脱细胞基质冻干纤维的制备方法，其特征是，没食子酸或单宁酸与脱细胞基质的质量比为0.01:1，辐照剂量为8kgy；

3.如权利要求1所述的脱细胞基质冻干纤维的制备方法，其特征是，一次交联反应的温度为20～30℃，反应时间为2～24h；反应时间优选为5～7h；

4.如权利要求1所述的脱细胞基质冻干纤维的制备方法，其特征是，冷冻干燥包括预冻过程和升华干燥过程；优选地，冷冻干燥的程序如下表所示：

5.一种脱细胞基质冻干纤维，其特征是，由权利要求1～4任一所述的制备方法获得。

6.一种脱细胞基质温敏凝胶的制备方法，其特征是，按照每毫升无菌溶剂添加5～50mg的上述脱细胞基质冻干纤维的比例，将所述脱细胞基质冻干纤维与所述无菌溶剂进行混合，即得。

7.如权利要求6所述的脱细胞基质温敏凝胶的制备方法，其特征是，所述无菌溶剂为ph为7.2～7.4磷酸盐缓冲液；

8.一种脱细胞基质温敏凝胶，其特征是，包括上述脱细胞基质冻干纤维与无菌溶剂，所述脱细胞基质冻干纤维与无菌溶剂的比例为5～50:1，mg/ml。

9.如权利要求8所述的脱细胞基质温敏凝胶，其特征是，在0～34℃温度下为溶胶液，在生理温度下固化为固态的凝胶。

10.一种权利要求8或9所述的脱细胞基质温敏凝胶作为载体在制备药物中的应用。