双靶向肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞的磷酸钙纳米药物的制备方法及应用

本发明属于生物制药领域，涉及治疗原位三阴性乳腺癌的一种新型高效靶向递药系统。

背景技术：

1、近年来，乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。最新癌症负担数据显示，乳腺癌发病率位居全球第一，致死率位居第二。三阴性乳腺癌(triple-negative breastcancer，tnbc)是缺乏雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人类表皮生长因子受体2(her2)表达的一类乳腺癌。相比于其它类型乳腺癌，其恶性程度最高、侵袭性最强，好发于年轻女性，易发生早期转移、复发率高，预后极差，是乳腺癌中最易致死的一种分型。手术切除是tnbc的首选治疗手段，但是因tnbc患者年龄较轻，手术切除一方面会给患者造成极大的心理负担，另一面，易复发和转移。化疗药物没有特异的靶向性，给药后全身分布，疗效差、副作用大。由于tnbc激素受体和生长因子受体表达均呈阴性，因此分子靶向疗法对其无效。pd-1/pd-l1抑制剂是近年来fda批准用于治疗tnbc的一种免疫检查点抑制剂，其临床效果显著，副作用也明显少于传统治疗手段。但其仅对pd-l1阳性的患者有效，而pd-l1的表达存在个体差异。据临床数据显示，仅约20％的患者能产生免疫应答。因此，开展tnbc的新型治疗策略研究具有重要的科学意义和临床应用价值。

2、研究表明，肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，cafs)细胞分泌的趋化因子cxcl12可驱动cxcl12/cxcr4信号轴，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。这提示，抑制cafs的活性可减少cxcl12的分泌，阻断cxcl12/cxcr4信号轴，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。cxcr4是cxcl12的特异性受体，与非tnbc相比，tnbc组织中cxcr4表达更高。这提示，采用cxcr4特异性小干扰rna(sicxcr4)沉默cxcr4蛋白，亦可阻断cxcl12/cxcr4信号轴，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此，若在抑制cafs活性的同时沉默肿瘤细胞中cxcr4蛋白，可双向阻断cxcl12/cxcr4信号轴，双倍提高对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制效果。然而，只阻断cxcl12/cxcr4信号轴不能强效杀伤肿瘤细胞和cafs，抑制其增殖。因此，需要一个强细胞毒性药物与sicxcr4共同递送至三阴性乳腺癌组织，强效杀伤肿瘤细胞和cafs，协同发挥抗原位三阴性乳腺癌增殖、迁移和侵袭作用。

3、羟基喜树碱(hydroxycamptothecin，hcpt)是从喜树中分离提取的一种微量生物碱，是一种强细胞毒性药物，其作用机制是通过与dna拓扑异构酶1/单链dna复合物结合形成稳定的共价化合物，抑制dna链的解旋及再连接，诱导dna链断裂，最终导致细胞凋亡。sicxcr4与hcpt联合用药，是治疗三阴性乳腺癌的一种新策略。然而，sicxcr4在血液循环中易被降解，hcpt脂、水不溶，临床上只能采用药效只有原结构10～20％的钠盐形式，毒副作用大，常在化疗后出现严重的骨髓抑制。因此，需要一个合适的载体将sicxcr4和hcpt共同递送至肿瘤组织，有效发挥抗肿瘤增殖、迁移和侵袭作用，同时减少毒副作用。

4、磷酸钙(cap)是小干扰rna的优良递送载体，具有转染效率高、生物相容性好、生物可降解等特点。cap还具有ph敏感性，在肿瘤细胞溶酶体微酸性环境中易被溶蚀。用cap作为载体负载小干扰rna，可避免小干扰rna在血液循环中被降解。由于hcpt结构中含有内酯环，碱性条件下内酯环打开，暴露出能够绑缚ca2+的羧基，从而巧妙负载hcpt。开环型hcpt在肿瘤组织偏酸性的微环境中可进一步转化为具有抗肿瘤活性的内脂型hcpt。因此，本发明采用cap作为载体，同时负载sicxcr4和hcpt，联合治疗原位三阴性乳腺癌。然而，cap制备的时候易聚集，不稳定，并且在体内分布无特异性。研究发现，制备cap时加入能束缚ca2+离子的基团如含有羧基、磷酸基团的药物或载体可增加cap纳米粒的稳定性。

5、透明质酸(hyaluronic acid，ha)含有大量的羧基基团，能够绑缚ca2+，形成稳定的cap纳米粒。此外，ha还是cd44受体的特异性配体，能够提高cap纳米粒的靶向性。我们实验室还发现，cd44在4t1细胞和cafs中均高表达。这提示，如果将ha修饰在cap载体上，不仅可以稳定cap，还能通过受体-配体结合的方式将药物递送至肿瘤细胞和cafs，实现双靶向治疗作用。

6、基于以上研究背景，我们构建了ha修饰的共载sicxcr4和hcpt磷酸钙纳米药物(s/hcpt@cap/ha)。通过ha的靶向作用，将sicxcr4和hcpt共同递送至三阴性乳腺癌细胞和cafs。hcpt能强效杀伤三阴性乳腺癌细胞和cafs，减少三阴性乳腺癌细胞的增殖和cxcl12的分泌。同时sicxcr4能沉默三阴性乳腺癌细胞中的cxcr4蛋白，sicxcr4和hcpt协同双向阻断cxcl12/cxcr4信号轴，抑制原位三阴性乳腺癌的增殖、迁移和侵袭。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种双靶向肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞的磷酸钙纳米药物的制备方法及应用。通过将ha修饰在共载sicxcr4和hcpt的磷酸钙载体上，提高磷酸钙纳米药物稳定性，并通过三阴性乳腺癌细胞和cafs中高表达的cd44受体将sicxcr4和hcpt共同递送至三阴性乳腺癌细胞和cafs。sicxcr4可沉默三阴性乳腺癌细胞中的cxcr4蛋白，hcpt可强效杀伤三阴性乳腺癌细胞和cafs，减少cxcl12的分泌。sicxcr4和hcpt各司其职、各负其责，协同双向阻断cxcl12/cxcr4信号轴，抑制原位三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，实现“一石二鸟”的双靶向治疗作用，从而提高原位三阴性乳腺癌的治疗效果。

2、本发明的技术方案是：一种双靶向肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞的磷酸钙纳米药物的制备方法，该双靶向磷酸钙纳米药物组成为sicxcr4、hcpt、无水氯化钙、磷酸氢二钠、透明质酸钠和depc水。

3、制备方法如下：以cap为载体材料，将带负电的sicxcr4和带正电的钙离子通过静电吸附形成含有sicxcr4和钙的复合物；在弱碱性条件下，hcpt结构中的内酯环打开，该复合物中过量的钙离子与开环hcpt结构上的羧基进行络合，形成含sicxcr4、钙和hcpt的络合物；最后，以ha为稳定剂，将上述络合物加入ha和磷酸氢二钠的混合溶液中，于37℃条件下孵育30分钟，再通过纳米沉淀法得到ha修饰的共载sicxcr4和hcpt磷酸钙纳米药物(s/hcpt@cap/ha)；s/hcpt@cap/ha的粒径为267.8nm，电位为-20.4mv，hcpt载药量为14.3％。

4、采用流式细胞仪考察s/hcpt@cap/ha对小鼠三阴性乳腺癌细胞(4t1细胞)和cafs的靶向性；采用mtt法考察s/hcpt@cap/ha对4t1细胞和cafs的细胞增殖的影响；通过活体成像仪观察s/hcpt@cap/ha对三阴性乳腺癌组织的靶向性；最后，动物水平考察s/hcpt@cap/ha对原位三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。多途径阐明s/hcpt@cap/ha治疗原位三阴性乳腺癌的作用及机制。

5、本发明的创新性在于：

6、1.以cap为载体材料，将带负电的sicxcr4与带正电的钙离子通过静电吸附作用形成含有sicxcr4和钙的复合物，然后在弱碱性条件下，开环型hcpt与上述复合物中过量的钙离子通过络合反应，形成hcpt与钙的络合物，最后以ha为稳定剂，将上述混合物加入ha和磷酸氢二钠的混合溶液中进行共沉淀，得到ha修饰的共载sicxcr4和hcpt的磷酸钙纳米药物(s/hcpt@cap/ha)，实现了sicxcr4和hcpt的高效共载。

7、2.ha不仅可以作为稳定剂，还可作为靶头提高s/hcpt@cap/ha的靶向性。ha是cd44受体的特异性配体，s/hcpt@cap/ha静脉入血后，可通过三阴性乳腺癌细胞和cafs中高表达的cd44受体靶向入胞，并在溶酶体酸性环境中释放出sicxcr4和开环型hcpt。sicxcr4通过沉默肿瘤细胞中的cxcr4蛋白阻断cxcl12/cxcr4信号轴。开环型hcpt进一步被酸化为具有抗肿瘤活性的内酯型hcpt，强效杀伤肿瘤细胞的同时，抑制cafs的活性，减少cxcl12的分泌，与sicxcr4协同双向阻断cxcl12/cxcr4信号轴，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

8、3.本研究通过静电吸附法、络合反应及共沉淀法巧妙地将sicxcr4和hcpt同时负载到cap载体上，制备过程不使用任何有机溶剂，载体材料生物相容性好，安全性高，生产可控性强，易于临床转化。