血小板外泌体的体外制备方法及其在抑制肿瘤中的应用与流程

本发明涉及生物医药，具体地说，涉及血小板外泌体的体外制备方法及其在抑制肿瘤中的应用。

背景技术：

1、外泌体是一种纳米级细胞外囊泡，直径在30-150纳米之间，可由多种细胞分泌，并在细胞间通讯中扮演重要角色。近年来，外泌体在肿瘤治疗中的研究和应用逐渐增多，其作为生物标志物可用于肿瘤早期诊断或治疗效果的监测；作为药物载体亦可携带抗癌药物或功能性基因，递送至肿瘤细胞。截至目前，已有多项外泌体相关产品（exosting™）或技术平台（exorneasy®）进入临床试验阶段，但目前尚未有血小板外泌体可单独作为活性成分用于肿瘤治疗的研究。

2、目前外泌体药物发展的主要瓶颈问题还包括：外泌体具有较高的异质性，其标准化和批量生产困难，难以满足大规模生产需求。因此，有必要对外泌体的生产和应用进行进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种新的抑制肿瘤的方法。

2、本发明提供了血小板外泌体在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

3、本发明还提供了血小板外泌体在制备减小肿瘤体积的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

4、本发明还提供了血小板外泌体在制备抗肿瘤转移的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

5、本发明研究发现，在肿瘤与血小板复杂的通讯环境中，血小板外泌体可以发挥抑制肿瘤细胞发生发展的作用，有效杀伤肿瘤细胞，延缓肿瘤的生长以及转移。且血小板外泌体作为体内固有成分，具有安全性和耐受性，为发展新型外泌体药物制剂提供了基础条件与构造优势，为癌症治疗提供了新方法，同时拓宽了目前外泌体药物的选择范围。

6、本发明的应用中，优选所述血小板外泌体为药物的唯一活性成分。

7、本发明的应用中，优选所述肿瘤为膀胱癌、黑色素瘤或血癌。

8、作为本发明所述血小板外泌体用于肿瘤治疗的优选实施方式，所述血小板外泌体可配置为浓度40 ug/ml的制剂进行使用。

9、本发明的应用中，所述血小板外泌体的制备方法包括：

10、（1）以佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯刺激体外培养的单一巨核细胞；

11、（2）离心收获血小板；

12、（3）可选地，以凝血酶刺激收获的血小板；

13、（4）离心获得血小板外泌体。

14、本发明通过培养血小板前体细胞——巨核细胞可在体外稳定大量的生产血小板外泌体。通过对巨核细胞的培养，本发明可确保外泌体的产量和质量具有批次间的稳定性，规避了外泌体产量低，异质性高、杂质多的问题，可以在体外大规模培养。且本发明血小板外泌体继承了亲本细胞血小板优异的肿瘤靶向能力，可用于实际肿瘤的体内治疗。

15、血小板外泌体的制备方法步骤（1）中，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯的作用浓度为450~550 nm，刺激时间为2.8-3.2天。

16、血小板外泌体的制备方法步骤（3）中，每1×109血小板，使用0.5-1u凝血酶（示例性的，凝血酶的剂量为0.5 u）进行刺激，刺激时间为刺激时间为2-2.5小时，刺激条件为37度，5% co2的气体环境。

17、发明人研究发现，当固定血小板数量后，凝血酶的剂量在上述范围内时，得到的产品综合数量更优。

18、本发明还提供一种血小板外泌体的制备方法，其如上所述。

19、优选，本发明制备的血小板外泌体的粒径分布为：100-150 nm，表面zeta电势分布为：-15 ±10 mv，产量为8.83×109±1.72×108，纯度大于95%。

20、本发明还提供一种治疗肿瘤的药物，其活性成分仅为血小板外泌体。

21、本发明的药物为一种新型通用型肿瘤靶向型活性药物。

22、本发明利用血小板和肿瘤的亲和力以及血小板外泌体的抗肿瘤效果可对多种实体瘤进行治疗，同时未来作为一个通用型的药物平台也可针对不同的肿瘤类型进行精准治疗，其可包括单独治疗，联合化疗、放疗、免疫治疗等其他抗肿瘤疗效的综合治疗。

23、本发明的有益效果至少在于：

24、本发明发现血小板外泌体制剂能够精准靶向肿瘤，滞留肿瘤部位，同时具有抗肿瘤作用，此作用只需要血小板外泌体单一成分，作用迅速，疗效优异。

25、此外本发明还提供了一种血小板外泌体制剂的体外培养方法，大大增加了血小板外泌体的产量，降低其异质性。且本制备原料常规、制备方法简单、均一性优异，有利于实际生产应用。

1.血小板外泌体在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

2.血小板外泌体在制备减小肿瘤体积的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

3.血小板外泌体在制备抗肿瘤转移的药物中的应用，所述血小板外泌体为药物的活性成分。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述血小板外泌体为药物的唯一活性成分。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为膀胱癌、黑色素瘤或血癌。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述血小板外泌体的制备方法包括：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯的作用浓度为450~550 nm，刺激时间为2.8-3.2天。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，每1×109血小板，使用0.5-1u凝血酶进行刺激，刺激时间为2-2.5小时，刺激条件为37度，5% co2的气体环境。

9.一种血小板外泌体的制备方法，其特征在于，如权利要求6-8中任一项所述。

10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，活性成分仅为血小板外泌体。