干细胞培养上清液柔性脂质体、制备方法及其在皮肤年轻态产品上的应用与流程

本发明属于医美，主要涉及干细胞上清夜柔性脂质体，特别涉及干细胞培养上清液柔性脂质体、制备方法及其在皮肤年轻态产品上的应用。

背景技术：

1、干细胞(stem cel1)是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的原始未分化细胞。干细胞可以通过分裂和分化产生单一功能细胞，生理情况下替代衰老或凋亡细胞，维持机体组织结构的完整和正常生理机能的发挥，病理情况下修复、替代病变缺失的组织细胞，改善或恢复受损组织的结构和功能。干细胞在组织修复、器官重建和基因治疗中发挥重要作用，是继手术治疗和药物治疗后最有临床应用价值医疗手段，对人类健康产生重要影响。以干细胞为核心的再生医学成为当今医学研究的热点和焦点。干细胞具有多种来源，且不同来源的干细胞有不同的分化潜能，临床治疗效果也不尽相同。其中成体干细胞，特别是间充质干细胞因其来源广泛，易于获取，体外可大量扩增，且免疫原性低下，是目前组织修复、器官重建和基因治疗首选的种子细胞来源。

2、干细胞的生物学特性：

3、自我更新能力 干细胞一旦形成，在机体终生都具有自我更新能力，不同于只有有限的自我更新能力的许多类型的祖细胞。干细胞通过不均分裂进行自我更新和产生分化祖细胞。成体干细胞能反复分化充满组织，这对维持机体的组织器官的稳定性有很重要的意义。

4、多能性或全能性 干细胞具有分化为多种细胞类型的潜能，但不同干细胞其分化潜能有所不同。如胚胎干细胞其具有全能性，可以分化发育成构成机体任何一部分组织器官的能力；成体干细胞具有多向分化潜能，即到了个体发育的定阶段，甚至成体，其仍有一部分细胞可以分化，负责组织的更新和修复，可以产生出几种不同类型的细胞。成年干细胞具有多能性且其多向分化潜能与其所处的微环境有绝对的关系，如羊骨髓间充质干细胞，当其处于不同诱导液中时其可分化为不同的细胞类型，所以其具有向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力。

5、高度增殖能力 干细胞在体内，高度扩增具有重大意义，如造血干细胞通过高度扩增，可以补充由于正常衰老死亡而丧失的血细胞:在体外扩增干细胞是干细胞研究及其应用的前提和关键。因此干细胞高度扩增对干细胞的研究和应用及其对机体正常功能的维持均起到了重要的作用。

6、目前将干细胞应用于祛斑祛皱护肤品的研究并不常见。目前现有的祛皱护肤品大多数是化学用品，随着女性开始注重护肤品的质量和安全性，生物来源的祛皱护肤品越来越受到青睐。因此，以干细胞为原料天然中药提取物为辅料制备祛斑祛皱扩肤品具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明使用干细胞上清液以及天然中药提取物制备成柔性脂质体，用于祛斑祛皱，其具体合成步骤如下：

2、s1、干细胞(mscs)的活化与培养：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的羊骨髓间充质干细胞(购自广州市超博科技有限公司)。快速将冻存管放入37℃水浴中迅速解冻，直至只有少量冰晶为止。将解冻后的细胞转移到含有其5-10倍体积的预热培养基的离心管中，即含体积分数20%胎牛血清、100 u/ml链青霉素的lg-dmem培养基。在1200-1500 r/min下离心5 min，以去除含有dmso的冻存液。然后用含体积分数20%胎牛血清、100 u/ml链青霉素的lg-dmem培养基重悬细胞，以约4×106的细胞密度1将细胞接种至t25培养瓶中，于37℃、5%co2，培养箱中培养。培养72h后，首次全量换液，此后每3 d换液一次 ， 直至原代细胞融合度达到 80%~90%时，用0.25% 胰酶消化，按 1:3 传代；

3、s2、干细胞(mscs)上清液的提取：取生长状况良好的第4代mscs 1×107个，以1×106个细胞的密度接种至t25胞瓶中，待细胞融合度达到50%时，pbs 洗3次，加入无胎牛血清的lg-dmem培养基，再加入白藜芦醇的甘油溶液在37℃、5% co2培养箱中继续培养。24 h后4℃下1000g离心10min，收集细胞上清液；

4、s3、干细胞上清液脂质体的制备：称取70-90mg卵磷脂和30-50mg胆固醇，加入10-20ml无水乙醇，待两者溶解 ，加入步骤s2中的到的干细胞上清液100-200ml及丁基间苯二酚与白藜芦醇复配的维生素e溶液15-30ml，超声，得到均一的乳液，40℃去除乙醇胶态后加入80-100ml的 ph为7的pbs 缓冲溶液，再蒸发到原体积的1/2，得到干细胞脂质体粗悬液。超声处理2min，即得到分散较好的干细胞上清液脂质体。

5、优选地：所述步骤s2所用白藜芦醇的甘油溶液的质量分数为1%，加入量是培养基的1v/v%。

6、优选地：所述步骤s3中的丁基间苯二酚与白藜芦醇复配的维生素e溶液，其中，丁基间苯二酚：白藜芦醇：维生素e按质量比1：1：2，溶于甘油，按照质量百分比，其中丁基间苯二酚和白藜芦醇的浓度为1%，维生素e的浓度为2%。

7、优选地：步骤s4所述卵磷脂：胆固醇的质量比为2：1。

8、本发明的有益效果在于：

9、1、本发明制备的柔性脂质体含有干细胞上清液可以修复皮肤组织。

10、2、本发明中使用了天然无害无刺激的白藜芦醇可以刺激干细胞的生长，分泌某些具有修复皮肤功效的活性因子。

11、3、本发明引入的丁基间苯二酚与白藜芦醇复配维生素e溶液可以抑制色素沉淀提高肌肤免疫力在祛斑美白方面有非常显著的效果。

12、4、本发明中的干细胞上清液与丁基间苯二酚与白藜芦醇复配维生素e溶液有意想不到的祛皱祛斑的协同作用。

1.干细胞培养上清液柔性脂质体制备方法，主要由干细胞上清液和多种中药提取物自组装组成，其特征在于：具体制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的干细胞培养上清液柔性脂质体制备，其特征在于：所述步骤s2所用白藜芦醇的甘油溶液的质量分数为1%，加入量是培养基的1v/v%。

3.根据权利要求2所述的干细胞培养上清液柔性脂质体制备，其特征在于：所述步骤s3中的丁基间苯二酚与白藜芦醇复配的维生素e溶液，其中，丁基间苯二酚：白藜芦醇：维生素e按质量比1：1：2，溶于甘油，其中丁基间苯二酚和白藜芦醇的浓度为1%，维生素e的浓度为2%。

4.根据权利要求3所述的干细胞培养上清液柔性脂质体制备，其特征在于：步骤s4所述卵磷脂：胆固醇的质量比为2：1。

5.权利要求1~4任意一项所述制备方法的得到的干细胞培养上清液柔性脂质体。

6.权利要求1~4任意一项所述制备方法的得到的干细胞培养上清液柔性脂质体或权利要求5的干细胞培养上清液柔性脂质体在皮肤年轻态产品上的应用。