一种植物乳杆菌胞外多糖复合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及化妆品，具体涉及一种植物乳杆菌胞外多糖复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是一类能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的通称，是典型革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢、大多数不运动、兼性厌氧或厌氧的球状或棒状菌。乳酸菌在发酵过程中会产生胞外多糖(exopolysaccharides，eps)，是指乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的黏液多糖或荚膜多糖的总称，可促进人体健康，具有提高免疫、抗炎症、平衡肠道菌群和抗肿瘤等多种益生功能。乳酸菌菌种不同其胞外多糖的产量、结构和功能性质明显不同，研究不同乳酸菌的产量及其功能结构，对于丰富乳酸菌胞外多糖的相关信息具有重要意义。

2、因此，从高产胞外多糖的菌株中分离提取保外多糖，研究其功能特性及生理功能，对于改善食品品质，扩展胞外多糖在化妆品、食品和制药方面的利用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种植物乳杆菌胞外多糖复合物及其制备方法和应用，具有较好的保湿、抗菌、抗炎、抗氧化、抗敏等性能，从而使得制得的产物具有较好的应用，可以作为一种安全、无毒、无免疫原性、有效的化妆品原料。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种植物乳杆菌胞外多糖复合物的制备方法，将植物乳杆菌t1经过发酵后，分离得到粗多糖，菌泥经过溶菌酶酶解获得溶菌体系，加入粗多糖处理，制得改性胞外多糖，与阿魏酸混合，活化反应后，加入抗菌肽和氨基化玻尿酸，搅拌反应，制得植物乳杆菌胞外多糖复合物。

4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

5、s1.发酵：将植物乳杆菌t1菌种种子液接种于发酵培养基中，发酵培养，过滤，固体为菌泥，滤液加入三氯乙酸去除蛋白，离心，收集上清液，加入乙醇沉淀，沉淀物洗涤，透析，冷冻干燥，制得粗胞外多糖；

6、s2.溶菌体系的制备：将菌泥加入水中，加入溶菌酶酶解，过滤，上清液冷冻干燥，制得溶菌体系；

7、s3.酶处理：将粗胞外多糖溶于水中，加入溶菌体系，加热处理，加入乙醇沉淀，沉淀物洗涤，透析，冷冻干燥，制得改性粗多糖；

8、s4.氨基化玻尿酸的制备：将玻尿酸溶于水中，加入n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐、己二酸二酰肼，调节溶液ph值，室温搅拌反应，调节溶液ph值为中性，透析，冷冻干燥，制得氨基化玻尿酸；

9、s5.缩合：将改性粗多糖、阿魏酸加入水中，加入n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，活化反应后，加入抗菌肽和氨基化玻尿酸，室温搅拌反应，透析，冷冻干燥，制得植物乳杆菌胞外多糖复合物。

10、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述植物乳杆菌t1菌种种子液的含菌量为108-109cfu/ml，接种量为1-2v/v％，所述发酵培养基的配方如下：蔗糖10-15g/l，葡萄糖12-15g/l，尿素3-5g/l，氯化钙0.5-1g/l，氯化镁0.2-0.5g/l，氯化钾0.2-0.4g/l，赖氨酸1-2g/l，叶酸0.2-0.4g/l，维生素b12 0.1-0.2g/l，维生素c 0.5-1g/l；所述发酵培养的条件为厌氧条件下，36-38℃，100-200r/min，发酵培24-48h，所述加入三氯乙酸至体系三氯乙酸含量为3-5wt％，所述加入乙醇至体系乙醇含量为50-70wt％，所述沉淀的时间为3-5h，所述透析的时间为40-48h。

11、作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述菌泥、溶菌酶的质量比为100:1-2，所述酶解的温度为30-35℃，时间为2-4h。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述粗胞外多糖、溶菌体系的质量比为100:0.5-1，所述加热处理的温度为35-40℃，时间为1-2h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为50-70wt％，所述沉淀的时间为2-4h，所述透析的时间为40-48h。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述玻尿酸、n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐、己二酸二酰肼的质量比为10：4-5：12-14，所述调节溶液ph值为4.7-4.8，所述室温搅拌反应的时间为2-3h，所述透析采用的透析袋孔径为5k-8kda，所述透析的时间为24-48h。

14、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述改性粗多糖、阿魏酸、n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、抗菌肽和氨基化玻尿酸的质量比为12-15:2-4:7-9:4-7:2-3:6-8，所述活化反应的温度为0-4℃，时间为20-40min，所述室温搅拌反应的时间为20-24h，所述透析采用的透析袋孔径为5k-8kda，所述透析的时间为24-48h。

15、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

16、s1.发酵：将含菌量为108-109cfu/ml的植物乳杆菌t1菌种种子液接种于发酵培养基中，接种量为1-2v/v％，厌氧条件下，36-38℃，100-200r/min，发酵培24-48h，过滤，固体为菌泥，滤液加入三氯乙酸至体系三氯乙酸含量为3-5wt％，离心，收集上清液，加入乙醇至体系乙醇含量为50-70wt％，沉淀3-5h，沉淀物洗涤，透析40-48h，冷冻干燥，制得粗胞外多糖；

17、所述发酵培养基的配方如下：蔗糖10-15g/l，葡萄糖12-15g/l，尿素3-5g/l，氯化钙0.5-1g/l，氯化镁0.2-0.5g/l，氯化钾0.2-0.4g/l，赖氨酸1-2g/l，叶酸0.2-0.4g/l，维生素b12 0.1-0.2g/l，维生素c 0.5-1g/l；

18、s2.溶菌体系的制备：将100重量份菌泥加入水中，加入1-2重量份溶菌酶，30-35℃酶解2-4h，过滤，上清液冷冻干燥，制得溶菌体系；

19、s3.酶处理：将100重量份粗胞外多糖溶于水中，加入0.5-1重量份溶菌体系，加热至35-40℃处理1-2h，加入乙醇至体系乙醇含量为50-70wt％，沉淀2-4h，沉淀物洗涤，透析40-48h，冷冻干燥，制得改性粗多糖；

20、s4.氨基化玻尿酸的制备：将10重量份玻尿酸溶于水中，加入4-5重量份n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐、12-14重量份己二酸二酰肼，调节溶液ph值为4.7-4.8，室温搅拌反应2-3h，调节溶液ph值为中性，采用孔径为5k-8kda的透析袋透析24-48h，冷冻干燥，制得氨基化玻尿酸；

21、s5.缩合：将12-15重量份改性粗多糖、2-4重量份阿魏酸加入水中，加入7-9重量份n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-7重量份n-羟基丁二酰亚胺，0-4℃活化反应20-40min后，加入2-3重量份抗菌肽和6-8重量份氨基化玻尿酸，室温搅拌反应20-24h，采用孔径为5k-8kda的透析袋透析24-48h，冷冻干燥，制得植物乳杆菌胞外多糖复合物。

22、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的植物乳杆菌胞外多糖复合物。

23、本发明进一步保护一种上述植物乳杆菌胞外多糖复合物在制备保湿、抗氧化、抗炎、抗敏类化妆品中的应用。

24、本发明具有如下有益效果：

25、通常，乳酸菌胞外多天存产量低、生产成本高、生产周期长、菌株稳定性低等因素，制约其实现工业化生产。本发明中选择的菌种植物乳杆菌t1是一种高产胞外多糖的菌种，在生长过程中会产生大量的附着于菌体细胞壁或分泌到细胞壁外的次级代谢产物。同时，本发明在发酵培养基中添加了较多的ca2+和mg2+,增加胞外多糖产量并改变其微观结构，使鼠李糖含量增加，上调了与鼠李糖生物合成相关的cps4f、rfbd基因的表达，以及与碳转运和代谢、脂肪酸合成、氨基酸合成、离子转运相关的大部分蛋白质的表达，有利于胞外多糖的合成，从而也提高了产率。另外，添加的赖氨酸和叶酸能提高菌种的抗逆性，延长其在稳定期的时间，从而大大提高了产物的收率。另外，ca2+还是葡聚糖蔗糖酶的重要组分之一，可以催化底物直接生成α-葡聚糖，催化形成的糖苷能够连接形成低聚糖，改善了胞外多糖的结构，使得制得的胞外多糖具有更好的抗氧化和抗炎性能。

26、发酵菌植物乳杆菌仍含有丰富的酶体系，能够促进多糖的糖苷键的合成，本发明采用溶菌酶酶解菌泥，然后与制得的粗胞外多糖发生酶反应，促进糖苷键等形成，生成活性更高的或者分子量更小，更容易发挥作用的改性粗多糖。

27、玻尿酸是一类保湿性、抗氧化性能很好的多糖，且安全、无毒、无免疫原性，通过氨基化反应后，能够与改性粗多糖、阿魏酸和抗菌肽发生缩合反应，具有良好的抗氧化活性，其中酸性胞外多糖和带有负电基团的胞外多糖表现出更强的抗氧化性，负电基团有利于胞外多糖水解从而暴露出更多的半缩醛羟基，表现出很强的清除dpph自由基、羟自由基、超氧自由基的能力，可以缓解细胞的氧化胁迫。另外，该胞外多糖复合物还具有较好的抗炎作用，可以促进巨噬细胞增殖和促炎因子的释放，促进肿瘤坏死因子-α、白介素的释放。

28、本发明制得的植物乳杆菌胞外多糖复合物具有较好的保湿、抗菌、抗炎、抗氧化、抗敏等性能，从而使得制得的产物具有较好的应用，可以作为一种安全、无毒、无免疫原性、有效的化妆品原料。