丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶及其制备与应用

本发明涉及生物医用材料，具体涉及丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶及其制备与应用。

背景技术：

1、金属离子是生命体中的关键调控因素，在维持生命稳态，促进不同组织修复以及治疗不同疾病等方面发挥重要作用。大多数金属离子的生物活性均有浓度依赖性，且浓度过高会导致细胞毒性，因此，如何有效控制金属离子的浓度，正确发挥金属离子的生物学活性是金属离子在再生医学领域应用的关键问题。

2、为避免离子的突释或过快消失，研究者开发出和高分子/大分子络合、生物矿化、生物玻璃等多种固定及缓释金属离子的方法。上述方法离子释放主要通过络合物或复合体系的降解来实现，但矿化物和生物玻璃等的降解行为难以有效调控，导致金属离子的活性发挥受到极大限制。在生命体内部，通过多肽和金属离子络合形成稳定络合物是金属离子发挥生物活性的可靠方法。蓝铜胜肽为多肽和铜离子形成的络合物，被认为是一种高效的生长因子，在体内具有促血管化/调控炎症等多种作用，并在功效护肤领域得到广泛应用，但其易于失活，且同多种活性分子均发生反应导致失活，因此，蓝铜胜肽在功效护肤领域配伍性差，应用空间有限。在避免金属离子副作用的同时，解决蓝铜胜肽稳定性和配伍性问题，亟需开发一种结构稳定且高效发挥金属离子生物活性的新型活性材料。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶及其制备与应用。

2、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了一种丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将丝蛋白为0.2～6wt％的丝蛋白纤维凝胶通过超声处理后得到直径为10～1200nm的丝蛋白纳米纤维或颗粒溶液；

5、(2)将金属盐水溶液在200～700rpm的搅拌速率下与步骤(1)得到的丝蛋白纳米纤维或颗粒溶液混合，得到丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒溶液，所述丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒溶液中金属离子的浓度为10～1000μm；

6、(3)将步骤(2)得到的丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒溶液进行离心处理，取上清液进行熟化处理将未络合的丝蛋白纳米纤维或颗粒转变为丝蛋白纳米纤维网络，得到丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶。

7、本发明首先对高晶丝蛋白纳米纤维进行处理，调控其纳米尺寸；在搅拌或超声条件下将合适浓度的金属盐水溶液加入到丝蛋白纳米纤维或颗粒溶液中，混合均匀；将混合物高速离心去除大尺寸聚集体，获得透明的丝蛋白-离子络合物纳米颗粒溶液；将络合物纳米颗粒溶液放置在合适温度下熟化，得到丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶，制备工艺简单，条件温和，有利于规模化生产和未来转化。

8、本发明在丝蛋白纳米纤维或颗粒和金属离子作用形成络合物的技术基础上，通过控制丝蛋白纳米聚集体的尺寸和金属离子浓度等参数，来控制丝蛋白-金属离子络合物形成速率和尺寸，同时调控丝蛋白聚集体和金属离子络合的比例/速率以及丝蛋白聚集体进一步聚集的行为，避免络合和丝蛋白聚集体再聚集过快导致的凝胶化，导致纳米颗粒尺寸过大和无序聚集形成不透明凝胶。

9、丝蛋白纳米纤维或颗粒溶液与金属离子络合的过程中有三种作用力存在：一是丝蛋白纳米纤维或颗粒与金属离子非共价作用形成聚集体；二是丝蛋白纳米纤维或颗粒与金属离子聚集体的再聚集；三是金属离子的加入导致丝蛋白纳米纤维或颗粒之间的斥力作用力下降，丝蛋白纳米纤维或颗粒之间的不可控聚集。因此，金属离子的浓度、丝蛋白聚集体和金属离子络合的比例和速率至关重要，三者共同微观调控聚集过程。并且，丝蛋白和金属离子络合速率的调控以及后期熟化诱导丝蛋白纳米纤维网络的形成是实现络合物尺寸调控和长期稳定分散的关键。

10、丝蛋白纳米纤维经过超声可尺寸降低，在提高其流动性同时，尺寸的降低可有效避免不可控的丝蛋白聚集体再聚集，是调控其和离子络合物尺寸的前提。随后，通过铜离子加入的浓度协同搅拌速率，加入速率，调节形成络合物的尺寸，避免络合物尺寸过快增长，导致尺寸过大，形成不透明聚集体。在离子溶液加入过程中，保持丝蛋白的过量，不仅相对降低离子加入时负电荷密度的下降程度，以维持足够的负电荷斥力避免丝蛋白之间的不可控聚集，同时可通过溶液中丝蛋白网络的存在同时抑制络合物的聚集，实现尺寸的控制和平衡。络合物完全形成后，体系中仍保留过量未作用的丝蛋白，其可通过电荷斥力和疏水作用的协同，重新生长，由超声后的颗粒转变成纤维，在转变的同时使得体系由溶液态变为凝胶态，实现体系的长期稳定。

11、所以，本发明首先通过高晶丝蛋白聚集体的纳米调控，优化其同金属离子的络合作用，随后利用合适浓度的金属离子，调控纳米化聚集体和金属离子的络合速率以及随着络合物形成引发的丝蛋白聚集体再聚集的速率，将丝蛋白-金属离子络合物的尺寸控制在200nm以下，并避免络合物以及丝蛋白聚集体的再聚集，形成络合物尺寸小且形态透明的溶液。为避免溶液状态下所形成络合物纳米颗粒进一步聚集，通过熟化工艺主动诱导溶液中丝蛋白聚集体的可控再聚集，形成纳米纤维网络将溶液转变成透明凝胶，将络合物纳米颗粒稳定分散在丝蛋白纳米纤维网络，实现络合物的长期稳定存储。

12、进一步地，步骤(1)中所述丝蛋白纳米纤维或颗粒溶液与步骤(2)中所述金属盐水溶液的体积比为(1～50):1，优选为(2～10):1。

13、丝蛋白纳米纤维或颗粒的加入量应多于金属离子，便于没有络合的丝蛋白纳米纤维或颗粒形成纤维网络，将丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒控制在网络内，达到长时间不聚集的稳定状态。

14、进一步地，在步骤(2)中，所述金属离子为铜离子、锌离子、铁离子、镁离子、锰离子和钙离子中的一种或几种。

15、本发明得到的水分散性良好且具有优异活性的丝蛋白-离子络合物纳米颗粒，能够满足组织再生修复，功效护肤等多层次需求，根据金属离子种类发挥抗菌、调炎、促血管、诱导干细胞分化等功能。

16、进一步地，步骤(2)得到的丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒在溶液中均匀稳定分散不聚集，尺寸在200nm以下，结构稳定，长时间保持透明状态，且具有优异生物活性。

17、不同尺寸的丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒的活性及功能完全不同，现有技术具有浓度依赖性，而本发明制备得到的丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒能够在水相稳定分散和存在，在该尺寸内可以实现多功能，在具有良好抗菌性，促血管化能力和抑炎性的同时，保持良好生物相容性，能够同不同活性成分配伍，实现生物活性、稳定性和可配伍性的统一，综合性能优于蓝铜胜肽。

18、进一步地，在步骤(3)中，所述离心处理的离心速率为1000～9000rpm。

19、进一步地，在步骤(3)中，所述离心处理的温度为0～90℃。

20、进一步地，在步骤(3)中，所述离心处理的时间为2～200min。

21、进一步地，在步骤(3)中，所述熟化处理的温度为0～100℃，时间为30min～240h。

22、丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒溶液长时间放置会沉积或聚集，因此，本发明通过简单的熟化工艺，主动诱导溶液中未络合的丝蛋白纳米纤维或颗粒再组装，形成稳定的纤维网络，从而将丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒固定，解决纳米颗粒在水相环境中长期稳定存在的问题。

23、本发明第二方面提供了一种第一方面所述的方法制备得到的能够充分发挥金属离子生物活性，在避免金属离子毒性的同时解决蓝铜胜肽等多肽-金属离子络合物配伍性差/稳定性差弱点的丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶。

24、进一步地，丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒在所述丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶中分散并被丝蛋白纳米纤维网络固定。

25、由于过量丝蛋白纳米纤维的存在，避免丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒的聚集，且纳米纤维的负电性同时抑制丝蛋白自身的聚集，同丝蛋白纳米纤维凝胶相似，本发明提供的丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶加入水后震荡即可得到丝蛋白-金属离子络合物纳米颗粒溶液。

26、本发明第三方面提供了一种第二方面所述的丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶在制备功效性护肤品中的应用。

27、本发明制备得到的透明的丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶，络合物纳米颗粒尺寸在200nm以下，能够在保持良好生物相容性的同时，具有抗炎/抗菌/促血管化等多种生物活性，同时优异的稳定性使其能够和维生素c，视黄醇等不同活性成分直接配伍，为功效护肤产品的灵活设计提供新的原料选择。

28、本发明的有益效果：

29、(1)本发明首先通过高晶丝蛋白聚集体的纳米调控，优化其同金属离子的络合作用，随后利用合适浓度的金属离子，调控纳米化聚集体和金属离子的络合速率以及随着络合物形成引发的丝蛋白聚集体再聚集的速率，将丝蛋白-金属离子络合物的尺寸控制在200nm以下，并避免络合物以及丝蛋白聚集体的再聚集，形成络合物尺寸小且形态透明的溶液。为避免溶液状态下所形成络合物纳米颗粒进一步聚集，通过熟化工艺主动诱导溶液中丝蛋白聚集体的可控再聚集，形成纳米纤维网络将溶液转变成透明凝胶，将络合物纳米颗粒稳定分散在丝蛋白纳米纤维网络，实现络合物的长期稳定存储，制备工艺简单，条件温和，有利于规模化生产和未来转化。

30、(2)本发明制备得到的透明的丝蛋白-金属离子络合物透明纳米凝胶，络合物纳米颗粒尺寸在200nm以下，能够在保持良好生物相容性的同时，具有抗炎/抗菌/促血管化等多种生物活性，同时优异的稳定性使其能够和维生素c，视黄醇等不同活性成分直接配伍，为功效护肤产品的灵活设计提供新的原料选择。