一种选育牙鲆克隆改良系的方法与流程

本发明属于鱼类遗传选育，具体涉及一种选育牙鲆克隆改良系的方法。

背景技术：

1、现有的牙鲆双单倍体(dh)和克隆系表现出生长慢、繁殖力弱和抗逆性差等问题。这个问题制约了鱼类双单倍体育种的规模化应用。因此，选育生长快、繁殖力高的克隆改良系，对于解决鱼类双单倍体育种实用性应用的问题非常重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种选育牙鲆克隆改良系的方法，该方法选育出生长快、繁殖力高的克隆改良系，能解决鱼类双单倍体育种实用性应用的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种选育牙鲆克隆改良系的方法，该方法为：

3、s1、高纯合度的牙鲆雌核发育二倍体制备

4、从核心种质群体中选择性状优良的牙鲆作为亲本，用冷休克法诱导牙鲆减数分裂雌核发育，得到牙鲆雌核发育二倍体，经微卫星分子标记纯合性鉴定后，选留纯合度大于0.8的个体1000尾牙鲆雌核发育二倍体作为后备亲鱼；

5、s2、牙鲆双单倍体dh制备

6、在s1中选留后的牙鲆雌核发育二倍体中选择性成熟期体重>3.0kg、性腺发育良好、体表无病无伤的雌性个体10尾，诱导有丝分裂雌核发育，用静水压抑制第一次卵裂，实现染色体加倍，获得牙鲆有丝分裂雌核发育二倍体，即双单倍体dh，经过高重组率微卫星标记鉴定，选留纯合度为1.0的个体1000尾牙鲆双单倍体dh作为后备亲鱼；

7、s3、双克隆杂交系制备

8、当s2中选留后的双单倍体dh培育成熟后，选择性成熟期的雌性>1.5kg，雄性>1.0kg，性腺发育良好、体表无病无伤的雌雄各10尾双单倍体dh个体作为亲本，进行杂交，获得双克隆杂交系；培育过程中，对所述双克隆杂交系进行生长性能评估，选留12月龄时体重>500g的个体500尾作为后备亲鱼；

9、s4、重组双单倍体rdh制备

10、当s3中选留后的双克隆杂交系培育性成熟后，在繁殖季节选择个体性成熟期体重>3.0kg，性腺发育良好，体表无病无伤的个体10尾作为亲本，再次诱导有丝分裂雌核发育，用静水压抑制第一次卵裂，实现染色体加倍，得到纯合的牙鲆重组双单倍体群体，即为牙鲆rdh群体；

11、s5、牙鲆重组双单倍体rdh的培育

12、将s4中得到的牙鲆rdh群体按照牙鲆苗种标准化培育规程进行养殖，6月龄后进行个体的pit标记，标记后在培育过程中每月进行表型测定，进行生长性能评估，12月龄时选留体重>500g，且纯度为1.0的个体500尾牙鲆重组双单倍体rdh；

13、s6、克隆改良系的制备和培育

14、当s5中选留的牙鲆重组双单倍体rdh培育至性成熟后，在繁殖季节选择性成熟期体重>3.0kg，性腺发育良好，体表无病无伤的雌性个体10尾作为亲本，诱导减数分裂雌核发育，得到牙鲆克隆系；

15、对所述牙鲆克隆系按照牙鲆苗种标准化培育规范进行养殖，养殖过程中，对不同克隆系进行生长性能评估，选留12月龄平均体重超过500g的家系作为候选克隆系；在性成熟期，将体重>3.0kg，且性腺发育良好，可育比例超过80％的家系作为克隆改良系。

16、优选地，s1中所述牙鲆的品种为渤海本地经济鱼类牙鲆(paralichthysolivaceus)。

17、优选地，s1中所述冷休克法为：将牙鲆卵子用灭活的真鲷精子体外受精后3min，在温度为0±0.5℃的海水中进行冷休克处理45min后，转移到温度为15℃的海水中孵化。

18、优选地，s2、s4中所述静水压的方法为：牙鲆卵子用灭活的真鲷精子体外受精后，在17℃的海水中孵化60min后，用65mpa的静水压处理6min。

19、本发明与现有技术相比具有以下优点：

20、本发明选育的生长快、繁殖力高的牙鲆克隆改良系，能解决鱼类双单倍体育种实用性应用的问题。

21、下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

1.一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，该方法为：

2.根据权利要求1所述的一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，s1中所述牙鲆的品种为渤海本地经济鱼类牙鲆（paralichthys olivaceus）。

3.根据权利要求1所述的一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，s1中所述冷休克法为：将牙鲆卵子用灭活的真鲷精子体外受精后3min，在温度为0±0.5℃的海水中进行冷休克处理45min后，转移到温度为15℃的海水中孵化。

4.根据权利要求1所述的一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，s2、s4中所述静水压的方法为：牙鲆卵子用灭活的真鲷精子体外受精后，在17℃的海水中孵化60min后，用65mpa的静水压处理6min。

5.根据权利要求1所述的一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，s1中所述微卫星分子标记纯合性鉴定中微卫星位点为: poli1076tuf、poli1077tuf、poli1831tuf、poli148tuf、poli9tuf、poli107tuf、poli159tuf、poli1825tuf、poli1936tuf、po15、poli907tuf、poli212tuf、poli966tuf、poli1819tuf、po13、po25a、poli1915tuf、poli1010tuf、poli1490tuf、poli1838tuf、poli1925tuf、poli1498tuf、poli-rc27-tuf和poli1872tuf；

6.根据权利要求1所述的一种选育牙鲆克隆改良系的方法，其特征在于，s2中所述高重组率微卫星标记鉴定中微卫星位点为:poli9tuf、poli107tuf、poli139tuf；