髓母细胞瘤的免疫微环境差异检测并分型方法及系统
背景技术：
：：1、髓母细胞瘤(medulloblastoma，mb)是后颅窝最常见的儿童脑肿瘤，约占所有儿童脑肿瘤的25％，呈侵袭性。转录组学、基因组学、表观基因组学和蛋白质组学分析表明，人类mb具有高度异质性。2、这些肿瘤被分为具有不同结果和分子特征的更精细的四个主要亚组:wnt(wingless-related integration site，wnt蛋白家族得名于果蝇的“wingless”基因和小鼠的“int-1”基因，它们在形态发生、细胞增殖和分化等过程中发挥重要作用)、sonichedgehog(音速刺猬，shh)、group3和group4，wnt和shh通常分别在wnt和shh通路基因中存在突变，gp3亚组肿瘤通常表现为myc(myelocytomatosis viral oncogene homolog，myc是一个重要的原癌基因，在细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用)扩增，临床结果最差，gp4的遗传驱动因素尚不清楚。3、虽然传统治疗方案已经取得了一定的进展，但对于某些高危患者而言，治疗效果依然不尽如人意，其生存率和预后仍然不乐观。因此，探索新的治疗策略和预测标志物显得尤为重要。4、肿瘤异质性指的是肿瘤组织由表达谱或生物学功能不同的细胞亚群组成，导致肿瘤在生长速度、侵袭转移能力以及对药物的敏感性等方面存在差异，这是恶性肿瘤的一个显著特征。这种异质性是肿瘤复发、转移和耐药的主要原因，直接影响着临床治疗效果。因此，分析肿瘤异质性具有重要的临床诊断价值，对肿瘤异质性形成及调控机制进行深入研究，将为肿瘤的精准靶向治疗提供理论支持。5、目前，关于肿瘤异质性形成的原因存在两种主要学说：克隆选择学说和肿瘤干细胞学说。克隆选择学说认为，肿瘤异质性源于单个肿瘤细胞群在发展过程中的继续突变。在适应环境的过程中，只有那些能够生存和繁殖的细胞群得以保留，最终导致肿瘤异质性的形成。而肿瘤干细胞学说认为，肿瘤是由一小群具有自我更新能力的肿瘤干细胞以及其分化程度不同的细胞组成，因此肿瘤表现出不同细胞类型的异质性。尽管两种学说的解释角度不同，但都强调了肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)在肿瘤异质性形成中的重要作用。6、肿瘤微环境是指肿瘤细胞发生和发展的内环境，包括肿瘤细胞本身、免疫细胞、基质细胞以及附近区域内的细胞间质、微血管和浸润其中的生物分子等。近年来，越来越多的研究表明，肿瘤免疫微环境在肿瘤的发生、发展和治疗反应中扮演着关键的角色。肿瘤微环境不仅影响着肿瘤细胞的生长和转移，还与治疗效果和患者预后密切相关。基于肿瘤微环境的个体化治疗越来越受到关注，特别是免疫治疗已广泛应用于临床治疗多种癌症，取得了显著效果。然而，对于髓母细胞瘤的肿瘤微环境了解尚不够充分。7、因此，深入了解髓母细胞瘤微环境的细胞组成、髓母细胞瘤癌细胞与微环境中其他细胞的相互作用以及髓母细胞瘤癌细胞对微环境的影响，将有助于发现髓母细胞瘤发生发展的生物标志物和潜在的治疗靶点，对于了解该肿瘤的发病机制、预测患者的疾病进展和制定个体化治疗方案具有重要意义。8、然而，目前对于髓母细胞瘤免疫微环境的研究尚处于起步阶段，尤其是对于不同免疫亚型的髓母细胞瘤的免疫特征和临床意义的认识尚不够深入。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种髓母细胞瘤的免疫微环境差异检测并分型方法及系统，获取髓母细胞瘤的免疫特征和潜在治疗靶点，为疾病的治疗和预后评估提供新的思路和方法。2、为了达到上述目的，本发明的基础方案为：一种髓母细胞瘤的免疫微环境差异检测并分型方法，包括如下步骤：3、s1，采集患髓母细胞瘤的样本的基因表达数据，并进行伪单细胞计算；4、s2，使用netclass生成蛋白互作网络作为邻接矩阵，将基因表达数据引入蛋白互作用网络，再结合伪单细胞化的基因表达数据，通过相似性网络融合分析进行无监督聚类确定髓母细胞瘤中不同的免疫微环境亚型；5、s3，通过lasso进行机器学习对不同的免疫微环境亚型进行生物学特征筛选；6、s4，通过单细胞组学分析进行免疫微环境分型和生物学特征筛选筛选的验证。7、本基础方案的工作原理和有益效果在于：本技术方案通过对不同亚型髓母细胞瘤微环境进行分型，获取不同亚型的mb患者肿瘤免疫微环境的异质性，并结合单细胞测序数据可视化，对其微环境景观差异进行深入研究。8、将mb分为具有不同生物学特征和临床特征的不同的亚型，并筛选出不同亚型具有预后差异的基因。不同亚型髓母细胞瘤中分别具有不同的免疫微环境亚型，这些亚型具有独特的marker和功能，在肿瘤发生发展过程中发挥着自己独特的作用，并给患者带来完全不同的结局。通过免疫微环境分型和marker筛选，揭示了髓母细胞瘤的免疫特征和潜在治疗靶点，为该疾病的治疗和预后评估提供了新的思路和方法。9、进一步，步骤s1具体为：10、基于ssgsea伪单细胞分析方法，将基因表达数据与给定的基因集进行比较，计算出每个样本中基因集的富集得分，模拟肿瘤的免疫微环境中免疫细胞的构成；11、基于netclass分析方法，利用蛋白互作ppi网络的信息，将基因表达数据和蛋白网络拓扑结构进行集成；12、将通过ssgsea方法得到的伪单细胞结果，结合基因表达数据对样本进行相似网络融合snf分析；13、采用r语言中的survival包和ggplot2包，estimate包，mcpcounter包，msigdbr包，分别对mb患者不同免疫亚型的生存数据进行可视化分析，对肿瘤微环境中的肿瘤微环境和不同细胞类型的丰度进行评估，对生物学过程相关的基因集合数据进行评估；14、使用glmnet包中的glmnet函数，对基因表达数据进行多分类的lasso回归分析；15、基于基因表达数据，利用r软件包limma(3.56.2)进行分组间差异表达基因deg分析，获取样本组间数据表达的差异情况；利用r软件包goplot(r 4.0.2)绘制气泡图，观察通路富集的情况。16、确定髓母细胞瘤中不同的免疫微环境亚型及对应的生物学特征，以便后续分析处理。17、进一步，基于netclass分析方法，利用蛋白相互作用网络的信息，将基因表达数据和蛋白网络拓扑结构进行集成，具体步骤为：18、从公开数据库或文献中获取蛋白相互作用网络的数据，构建一个包含蛋白质之间相互作用关系的网络，作为邻接矩阵；19、计算扩散核：接受邻接矩阵作为输入，并根据指定的参数计算扩散核矩阵，指定的参数(p和a)，通过迭代计算生成扩散核矩阵，在计算扩散核矩阵时，通过判断参数is.adjacency来确定输入的是邻接矩阵还是拉普拉斯矩阵，选择不同的计算路径；20、使用igraph库来处理图形操作，包括创建无向图、计算拉普拉斯矩阵；21、在计算扩散核矩阵和后续的特征向量乘法时，使用矩阵运算，筛选出与另一个数据集的交集，然后利用交集的部分数据计算扩散核。22、netclass用于分析基因表达数据，并结合蛋白相互作用网络的拓扑结构来识别具有生物学意义的基因模式。23、进一步，将通过ssgsea方法得到的伪单细胞结果，结合基因表达数据对样本进行相似网络融合snf分析的方法为：24、使用去除假基因后表达的完整矩阵、ssgsea矩阵作为输入；25、使用snftool r包(v2.2.0)，邻居数量k＝30,高斯核参数alpha＝0.5,迭代次数t＝10，在snf融合相似矩阵上运行snf工具包实现的谱聚类，得到最合适的分组；26、分别在不同亚型里进行snf分析：在shh(样本数量n＝233)亚型中，在k＝3时得到3个免疫微环境的亚群；27、在gp3(n＝144)亚型中，在k＝2时得到2个免疫微环境的亚群；28、在gp4(n＝326)亚型中，在k＝3时得到3个免疫微环境的亚群。29、netclass分析结合snf分析将不同亚型mb肿瘤微环境分型，操作简单。30、进一步，采用r语言中的survival包和ggplot2包，estimate包，msigdbr包，mcpcounter包，分别对mb患者的生存数据进行可视化分析，对基因表达数据进行肿瘤微环境的评估，获取物种的基因组学数据库中与生物学过程相关的基因集合数据，对肿瘤微环境中不同细胞类型的丰度进行评估的步骤为：31、s11，准备生存分析所需的数据，包括每个样本的观察时间futime和事件状态fustat，以及用于分组的变量group；32、s12，使用survfit()函数拟合生存曲线，根据指定的观察时间和事件状态及分组变量group计算生存曲线；33、s13，使用ggsurvplot()函数创建生存曲线的图表，在图表中设置不显示置信区间(conf.int＝f)、显示风险表(risk.table＝t)、不添加总患者生存曲线(add.all＝f)、自定义调色板(palette＝"dark2")参数，调整标题、轴标题、字体大小和风格，以及坐标轴的范围；34、s21，准备基因表达数据文件，使用outputgct()函数将数据转换为estimate包所需的输入格式，并保存为新的文件(in.gct.file)；35、s22，使用filtercommongenes()函数从原始数据中过滤出常见的基因并保存为新的输入文件，使用estimatescore()函数计算肿瘤样本的estimate评分，并将评分结果保存为gct格式的文件(out.score.file)；36、s23，然后使用plotpurity()函数可视化样本的纯度评分，利用read.table()函数读取评分结果文件，并将其转换为数据框格式，最终将结果保存为文本文件(estimate_score.txt)；37、s31，使用msigdbr()函数从物种的基因组学数据库中获取c5类别的基因集合数据，并保存在go_df_all数据框中；38、使用dplyr::select()函数选择了所需的列(gs_name、gene_symbol、gs_exact_source和gs_subcat)，并根据子类别(gs_subcat)过滤不需要的数据，得到最终的go基因集合数据(go_df)；39、s32，使用split()函数将基因集合数据按照go条目名称gs_name进行分组，得到一个基因列表(go_list)；40、将待分析的基因表达数据(rt1)使用gsva()函数进行基因集合变异性分析gsva，计算每个go条目的基因集合变异性得分(gsva_mat)，并将结果保存在文本文件中(gsva_hallmark.txt)；41、s33，设置参数：使用高斯核密度估计函数(kcdf＝"gaussian")，并调用所有可用核(parallel.sz＝parallel::detectcores())；42、s41，读取mcpcounter评估所需的数据，包括细胞类型的基因表达数据(mcp_counter_tz.txt)和基因信息数据(mcp_counter_gene.txt)；43、s42，使用mcpcounter.estimate()函数对肿瘤样本中的细胞类型丰度进行估算，指定细胞类型的基因表达数据(probesets参数)、细胞类型的基因信息(genes参数)以及特征类型(featurestype参数)；44、s43，将评估结果保存在results对象中，进行可视化，了解不同细胞在免疫微环境中的丰度。45、采用r语言中的多个包进行数据分析，便于操作。46、进一步，步骤s3中，使用glmnet包中的glmnet函数，对基因表达数据进行多分类的lasso回归分析的方法为：47、使用glmnet函数拟合一个多项式logistic回归模型，其中自变量x是样本的基因表达，因变量y是样本的分类标签，使用family参数指定多项式的分布类型为multinomial，并通过type.multinomial参数设置组合的方式；48、使用plot函数对拟合的模型进行可视化，设置x轴为正则化惩罚项的系数lambda并标记每个系数的值；49、使用cv.glmnet函数进行lasso回归模型的交叉验证，选择最优的lambda值，根据最优的lambda值，使用glmnet函数重新拟合lasso回归模型，其中alpha参数设为1表示使用lasso回归，lambda参数设为交叉验证得到最优值，family参数和type.multinomial参数与之前相同；50、提取出lasso回归模型中系数不为0的基因，并将其保存为gene_min。51、使用glmnet包中的glmnet函数，对基因表达数据进行多分类的lasso回归分析。52、进一步，基于基因表达数据，利用r软件包limma(3.56.2)进行分组间差异表达基因deg分析，获取样本组间数据表达的差异情况；利用r软件包goplot(r 4.0.2)绘制气泡图，观察通路富集的情况，具体步骤如下：53、使用limma包进行差异表达基因分析：54、设计矩阵创建：使用model.matrix函数创建一个设计矩阵(design)，该矩阵用于描述实验设计中的处理组(group)；55、对照矩阵创建：使用makecontrasts函数创建对照矩阵(contr.matrix)，定义两个对照组之间的对比(c1vsc2)，其中c1和c2是设计矩阵中的两个对照组；56、线性模型拟合：使用lmfit函数拟合一个线性模型(vfit)，该模型用于拟合表达数据(y)和设计矩阵(design)；57、对比拟合：使用contrasts.fit函数对线性模型进行对比拟合，传入对照矩阵(contr.matrix)；58、贝叶斯估计：使用ebayes函数对对比拟合后的模型进行贝叶斯估计，以获得基因的显著性；59、诊断图绘制：使用plotsa函数绘制了模型的诊断图，用于评估模型的合适性和稳定性；60、显著性检验：使用decidetests函数对模型进行显著性检验，并输出基因的显著性检验结果的摘要信息；61、差异表达基因分析：使用toptable函数根据贝叶斯估计的结果获取所有基因的差异表达情况，然后根据给定的阈值(padj和foldchange)筛选出显著差异表达的基因；62、结果输出：将筛选后的显著差异表达基因写入csv文件中；63、degs功能注释及富集分析，使用r软件包clusterprofiler对筛选出的差异表达基因(degs)进行go功能注释和kegg富集分析，仅当p值小于0.05时，认为富集结果具有显著性，具体为：64、基因id转换：使用bitr函数将基因符号从symbol转换为entrezid；65、go分析：使用enrichgo函数进行go富集分析，指定基因id的类型、p值和q值的阈值参数，结果保存为ccgo.rdata文件；66、kegg分析：使用enrichkegg函数进行kegg富集分析，指定物种、p值和q值的阈值等参数，结果保存为cckegg.rdata文件；67、go/kegg富集可视化：使用barplot和dotplot函数对go和kegg富集结果进行可视化，并将图像保存为pdf文件；68、基因集对比分析：使用enrichkegg函数，对不同组间的基因进行kegg富集分析，比较不同组的kegg富集结果，并将结果进行可视化。69、基于基因表达数据，利用r软件包limma(3.56.2)进行分组间差异表达基因deg分析，获取样本组间数据表达的差异情况。并利用r软件包goplot(r 4.0.2)绘制气泡图，观察通路富集的情况。70、进一步，步骤s4通过单细胞组学分析进行免疫微环境分型和生物学特征筛选筛选的验证的方法为：71、采集患髓母细胞瘤的样本的单细胞数据，并使用seurat进行单细胞数据的质控和降维聚类；72、结合收集到的注释信息，对降维聚类的细胞亚群进行注释；73、使用r包scrnatoolvis，获取特定标志物maker在单细胞亚群中的分布状态，及不同免疫微环境亚型的髓母细胞瘤患者单细胞水平的差异；74、采集患髓母细胞瘤的样本的单细胞数据，并使用seurat进行单细胞数据的质控和降维聚类的方法为：75、对于每个样本，对umi数、全部基因数、线粒体基因数以及核糖体基因数进行统计，将过滤掉总基因数大于6000或基因数小于200的细胞，以及线粒体基因比例大于30％的细胞；76、针对每个样本，根据所有基因的平均值和分散度，确定前2000个变异程度最大的基因，用于整合分析，消除样本之间的批次效应，对整合后的数据进行主成分分析pca降维处理，保留前20个主成分，以捕获数据中的主要变化；77、用seurat的pipeline检测hgv，计算每个基因的平均表达和分散度，将基因放入箱中并计算每个箱内分散度的z分数；使用0.5的z-score作为离散度的截止值，使用0.0125的下限和3.0的高截止值作为平均表达，采用主成分分析pca进行线性降维，采用elbowplot法和jackstraw法选取具有统计学意义的主成分；采用seurat基于umap将聚类可视化，具体步骤如下：78、jackstraw:使用jackstraw方法对pca的结果进行评估，识别显著主成分；79、scorejackstraw:对jackstraw方法的结果进行评分，确定具有统计显著性的主成分；80、jackstrawplot和elbowplot:可视化jackstraw方法的结果，选择保留的主成分数量，jackstrawplot用于观察每个主成分的p值，elbowplot则用于观察方差解释程度的变化情况，通常选择"肘部"处的主成分数量；81、细胞聚类：82、findneighbors:基于pca的结果，计算细胞之间的邻近关系；83、findclusters:在k近邻图的基础上，使用聚类算法将细胞划分为不同的细胞群集；84、idents和table:查看聚类的结果，利用idents查看每个细胞所属的簇，table用于统计每个簇的细胞数量；85、umap降维和可视化：86、runumap:使用umap算法对数据进行降维，umap使用随机梯度下降优化算法，基于最小生成树和高斯混合模型的近似方法，采用一种基于距离的加权函数，调整不同数据点之间的相似性权重，将高维数据映射到二维或三维空间；87、最小化高维空间中数据点之间的距离和低维空间中的对应点之间的距离之间的损失函数，优化低维空间中的数据表示；88、dimplot:在umap降维的基础上，绘制细胞的分布图，直观地展示不同细胞群集之间的关系和分布情况；89、umap聚类可视化结果显示，来自shh、gp3、gp4的26个样本的个细胞，分别聚类为21(shh)、18(gp3)、15(gp4)个亚群。90、采集患髓母细胞瘤的样本的单细胞数据，并使用seurat进行单细胞数据的质控和降维聚类，便于使用。91、进一步，结合收集到的注释信息，对降维聚类的细胞亚群进行注释的方法如下：92、对mb患者样本和来自复发的单个匹配样本，进行scrna测序通过质量控制的细胞被投影为二维umap图，根据cell marker数据库和其他脑肿瘤相关文献的标记基因，手动对本实验中的细胞亚群进行注释。93、结合收集到的注释信息，对降维聚类的细胞亚群进行注释。94、本发明还提供一种髓母细胞瘤的免疫微环境差异检测并分型系统，包括处理单元，所述处理单元执行本发明所述方法，进行髓母细胞瘤的免疫微环境差异检测并分型。95、本系统通过处理单元，获取特定标志物maker在单细胞亚群中的分布状态，及不同免疫微环境亚型的髓母细胞瘤患者单细胞水平的差异，为疾病的治疗和预后评估提供新的思路和方法。当前第1页12当前第1页12
文档序号 :
【 40236778 】
技术研发人员：尹晴,李禄生,寸玉鹏,范金花
技术所有人：重庆医科大学附属儿童医院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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