一种仿生纳米囊泡及其制备方法与应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种仿生纳米囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

1、癌症免疫治疗是近年来肿瘤学领域的一项重要进展，其中的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，icis）为部分癌症患者带来了显著生存获益。作为一种免疫检查点受体，程序性细胞死亡受体1（programmed cell death receptor-1，pd-1）通过与其主要配体（programmed cell death receptor-ligand 1，pd-l1）结合，阻碍了t细胞效应因子对抗癌症的功能。基于pd-1/pd-l1的肿瘤免疫治疗已被证明在黑色素瘤和三阴性乳腺癌的治疗中具备有效性。然而，由于免疫激活不足，例如肿瘤细胞固有的低免疫原性、免疫细胞浸润不足或耗尽、肿瘤免疫微环境呈现抑制性等原因，导致免疫治疗的应答率较低，仅有20%~30%的癌症患者能从pd-1/pd-l1抑制剂中获益，甚至部分患者会不可避免地发生快速进展和恶化的情况。

2、研究表明，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶合酶-干扰素基因刺激因子（cyclic gmp-ampsynthase - stimulator of interferon genes，cgas-sting）通路的激活与肿瘤的发生发展有十分紧密的联系，其通常被认为是肿瘤免疫的有效调节器。除了肿瘤细胞中的cgas-sting通路会被激活导致肿瘤细胞凋亡或死亡，在肿瘤浸润树突状细胞的细胞质中也发现了肿瘤来源的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，dna），并能够激活cgas-sting通路，促进肿瘤特异性抗原呈递和细胞毒性t淋巴细胞（cytotoxic t lymphocyte，ctl）活化。值得注意的是，陈志坚教授团队发现了pd-l1阻断剂在sting敲除小鼠中的抗肿瘤效果会有所减弱。因此认为，sting通路的激活有望增强icis的治疗效果。这些发现强调了cgas-sting通路在肿瘤免疫中的重要作用，目前越来越多的研究集中在sting激动剂的合成和筛选上，其中最经典的第一代sting激动剂是环二核苷酸（cyclic dinucleotide，cdn）类似物，但是它们往往面临血浆清除快、细胞膜通透性差、无法到达细胞质等限制。

3、光免疫疗法是光疗和免疫疗法相结合的新型治疗方法，与单一的治疗方式相比，该方法可以显著提高治疗效果，目前已有多种光敏剂用于光免疫治疗。作为光敏剂，吲哚菁绿（indocyanine green，icg）能在808 nm近红外光照射下实现光动力治疗（photodynamictherapy，pdt）和光热治疗（photothermal therapy，ptt）。肿瘤免疫杀伤效应包括肿瘤抗原释放，抗原提呈，免疫系统激活，t淋巴细胞迁移，t淋巴细胞浸润，识别肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞这七个步骤。免疫细胞少、难以渗透的被称为“冷肿瘤”。icg在杀伤肿瘤细胞提供肿瘤特异性抗原的同时也具有免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，icd）诱导潜能。在icd过程中，肿瘤细胞可通过释放大量的损伤相关分子模式（damage associatedmolecular patterns，damps）激活树突状细胞从而诱导抗肿瘤免疫应答，启动级联过程，导致抗原特异性t细胞应答。然而，icg存在着一些缺点，如光稳定性差、光热能力弱、非特异性靶向以及在活体组织内快速被降解和清除等，限制了其在肿瘤治疗中的潜力。

4、在应对这些挑战的可能策略中，细胞膜衍生的纳米囊泡（nanovesicles，nvs）提供了一种具有前景的药物递送方案。由于其生物物理学特性，细胞膜衍生的纳米囊泡如外泌体、大囊泡和膜挤压囊泡，在输送药物方面具有巨大潜力。它们具有良好的生物相容性、低毒性和低免疫原性，从而在细胞间通讯方面发挥着至关重要的作用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在不足，本发明提供一种仿生纳米囊泡及其制备方法与应用，将pd-1蛋白、sting激动剂和近红外探针整合到仿生细胞膜囊泡中，得到最终产物cdn@pm-icg。

2、本发明采用的技术解决方案是：一种仿生纳米囊泡，所述的仿生纳米囊泡由细胞膜与pd-1蛋白，sting激动剂以及光敏剂组成，其中细胞膜与pd-1蛋白为表达pd-1的细胞的细胞膜，sting激动剂为环二核苷酸（cdn）类似物。

3、所述的环二核苷酸（cdn）类似物为sting激动剂2',3'-cgamp。

4、所述的光敏剂为光敏剂吲哚菁绿（icg）。

5、所述的表达pd-1的细胞为表达pd-1的hek 293t细胞。

6、所述的仿生纳米囊泡为表达pd-1的hek 293t细胞的细胞膜负载光敏剂吲哚菁绿（icg）和sting激动剂2',3'-cgamp得到。

7、一种仿生纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

8、s1、构建包含pd-1基因的慢病毒，使用该慢病毒转染hek 293t细胞，培养后，筛选出转染成功的细胞，获得pd-1蛋白的稳定表达系，将稳定表达pd-1蛋白的hek 293t细胞培养，收集这些细胞；

9、s2、用hepes-naoh、edta、蔗糖和蛋白酶抑制剂，且ph 7.4的均质培养基（hm）重悬细胞，之后，冰上超声波破碎，离心获得细胞膜片段后和sting激动剂多次过滤；0.8 μm过滤器至少10次，然后0.22 μm过滤至少10次；

10、s3、将icg和s2得到的细胞膜片段和sting激动剂泡搅拌过夜并再次通过多次过滤后共挤压得到仿生膜纳米囊泡。

11、所述的步骤s2中多次过滤为先0.8 μm过滤器至少10次，然后0.22 μm过滤至少10次。

12、所述的步骤s3中多次过滤后共挤压为通过0.8 μm及0.22 μm过滤后共挤压。

13、一种仿生纳米囊泡在制备肿瘤的光免疫治疗药物上的应用。

14、本发明的有益效果是：本发明提供了一种仿生纳米囊泡及其制备方法与应用，本发明将pd-1蛋白、sting激动剂和近红外探针整合到仿生细胞膜囊泡中，制得最终产物cdn@pm-icg，尾静脉注射该仿生纳米囊泡，其被动靶向到肿瘤组织后，给予的激光照射会使之产生光热和光动力效应，并且破坏囊泡结构，释放出cdn，其中pd-1蛋白可以有效破坏pd-1/pd-l1免疫抑制轴，icg介导的光疗可以破坏肿瘤细胞，释放出的cdn会激活胞内的sting信号通路并协同光疗介导的icd，诱导树突状细胞成熟，促进巨噬细胞向m1极化，激活cd8+t细胞，从而达到提高tnbc疗效的目的。

1.一种仿生纳米囊泡，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡由细胞膜与pd-1蛋白，sting激动剂以及光敏剂组成，其中细胞膜与pd-1蛋白为表达pd-1的细胞的细胞膜，sting激动剂为环二核苷酸（cdn）类似物。

2.根据权利要求1所述的一种仿生纳米囊泡，其特征在于，所述的环二核苷酸（cdn）类似物为sting激动剂2',3'-cgamp。

3.根据权利要求2所述的一种仿生纳米囊泡，其特征在于，所述的光敏剂为光敏剂吲哚菁绿（icg）。

4.根据权利要求3所述的一种仿生纳米囊泡，其特征在于，所述的表达pd-1的细胞为表达pd-1的hek 293t细胞。

5.根据权利要求4所述的一种仿生纳米囊泡，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡为表达pd-1的hek 293t细胞的细胞膜负载光敏剂吲哚菁绿（icg）和sting激动剂2',3'-cgamp得到。

6.一种权利要求1所述的仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤s2中多次过滤为先0.8 μm过滤器至少10次，然后0.22 μm过滤至少10次。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤s3中多次过滤后共挤压为通过0.8 μm及0.22 μm过滤后共挤压。

9.一种权利要求1所述的仿生纳米囊泡在制备肿瘤的光免疫治疗药物上的应用。