一种含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液及其制备方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液及其制备方法。

背景技术：

1、随着年龄的增加和生活环境的变化，皮肤的新陈代的会出现干燥、粗糙、脱皮等现象，痘印、晒伤、暗疮等疤痕。

2、目前，大量研究表明，干细胞可以分泌多种细胞因子对组织进行修复，比如：分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等。在众多干细胞中，最常用的是间充质干细胞(mesenchymalstem cells，mscs)。其来源广泛，现已从骨髓、外周血、胎盘、脂肪、羊膜、脐血、脐带等组织中分离出了间充质干细胞。其中外周血、骨髓间充质干细胞培养时间长，含量少，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降；羊膜组织是人体内唯一不含血管、淋巴和神经的组织，仅由羊水提供营养就能存活，活力强，同时取材方便，来源丰富、不涉及伦理问题等优点，成为极有潜力、优质的mscs来源。

3、羊膜间充质干细胞是来源于羊膜组织，其分泌表皮细胞生长因子(egf)等多种细胞因子，能够快速修复受损皮肤，诱导血管新生，刺激特定细胞群分裂增殖修复组织能力。

4、随着生物技术的不断发展，细胞因子已应用到皮肤修复产品中，但大多产品的制备方法过于复杂，不能满足皮肤修复产品中的大量需求，且制备过程耗时较长。目前，中国专利cn108853001a公开了一种含有干细胞提取物的皮肤乳液及其制备方法，该皮肤乳液中的干细胞提取物是利用华通氏块分离、培养得到的mscs经过解破碎、离心后取上清得到的。虽然该方法较为简单，但实际上干细胞提取物中除了皮肤修复作用的细胞因子外，还含有其他物质，提取不完全，导致所得到的乳液的保湿、淡斑、减皱等皮肤修复效果差。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液及其制备方法，旨在解决现有技术中的干细胞提取不完全，导致所得到的乳液的保湿、淡斑、减皱等皮肤修复效果差的问题。

2、为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

3、第一方面，一种含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

4、a. 羊膜间充质干细胞因子的制备：经羊膜间充质干细胞的分离与培养、传代培养、上清液收集和上清液浓缩，得到羊膜间充质干细胞因子；

5、b.制备含羊膜间充质干细胞因子的乳液：分别取emulium mellifera mb（聚甘油-6二硬脂酸酯、霍霍巴脂类、聚甘油-3蜂蜡酸酯、鲸蜡醇） 1-3份、emulcire 61 wl 2659 cgmb（鲸蜡醇、鲸蜡醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-20）0.25-1份、c10-c18脂酸甘油酯类1.5-6份、葵二酸二乙基乙酯1.5-5份、辛酸/葵酸甘油三酯3-7份、牛油果树果脂0.5-2份、辛基十二醇肉豆蔻酸酯2.5-7份、聚甲基倍半硅氧烷0.5-3份搅拌混匀，得到第一混合物；

6、取欧洲白蜡树树皮提取物0.5-3份、丙二醇2.5-8份、甘油2.5-8份均匀，得到第二混合物；

7、取步骤a得到细胞因子与比例为1:1的第一混合物和第二混合物混匀、静置，得到含羊膜间充质干细胞因子乳液。

8、进一步的，步骤a所述的羊膜间充质干细胞因子的制备，具体步骤如下：

9、步骤1、羊膜间充质干细胞分离与培养：取健康人羊膜组织5×5cm2，用ph7.2磷酸缓冲液充分清洗，将羊膜置于含0.1万u/ml庆大霉素和2.5μg/ml两性霉素b的生理盐水中，浸泡15-20min；将羊膜剪碎，先用终浓度2.5g/l胰蛋白酶，37℃消化20-30min后，取消化液800-1000r mp／min离心3-5min,弃去上清；共2-4次，然后用dmem／f12培养液中止胰蛋白酶，采用含加入终浓度为1.0g/l胶原酶ⅳ和0.1g/l脱氧核糖核酸酶ⅰ的vdmem：vf12=1：1的dmem／f12培养液，于37℃消化30-60min，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，800-1000rpm／min，离心5-10min，用ph7.2磷酸缓冲液pbs洗2-4次；弃去上清液，即获得羊膜间充质干细胞；以2×107l-1∽2×108l-1密度接种于培养基中培养；

10、步骤2、羊膜间充质干细胞传代培养：吸弃步骤1中待传代细胞的培养液，加入终浓度为2.5g/l胰蛋白酶，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后，加细胞传代培养基终止消化，快速震荡，吹打细胞，吸出细胞悬液，加入生理盐水洗涤，离心，收集沉淀，用pbs缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行p1代培养，细胞生长铺满至瓶底底面积的80％-90％时，继续进行传代培养，传代至p5代；

11、上清液的收集：收集培养p1-p4代羊膜间充质干细胞的上清液；

12、步骤3、上清液的浓缩：将步骤2收集到的上清液用截留分子量为100,000da和1000da的滤膜依次过滤、10-20倍浓缩，0.22μm滤膜除菌过滤，得到羊膜间充质干细胞因子浓缩液。

13、进一步的，所述的羊膜间充质干细胞所用的培养条件为37℃和5％co2的饱和湿度。

14、进一步的，步骤2中所述接种的细胞密度为2×107l-1-2×108l-1。

15、进一步的，所述的完全培养基包括：采用vdmem：vf12=1：1的dmem／f12无血清培养基，体积分数为15.0-15.6g/l，其中含有体积分数为5.0-10×10-1%的人血清白蛋白、1.0-5.5×10-1g/l的人转铁蛋白、5.0-10×10-1g/l的人胰岛素、5.2-6.7×10-4g/l的亚硒酸钠。

16、进一步的，步骤b中所述的取emulium mellifera mb（聚甘油-6二硬脂酸酯、霍霍巴脂类、聚甘油-3蜂蜡酸酯、鲸蜡醇）1-3份、emulcire 61 wl 2659 cg mb（鲸蜡醇、鲸蜡醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-20）0.25-1份、c10-c18脂酸甘油酯类1.5-6份、葵二酸二乙基乙酯1.5-5份、辛酸/葵酸甘油三酯3-7份、牛油果树果脂0.5-2份、辛基十二醇肉豆蔻酸酯2.5-7份、聚甲基倍半硅氧烷0.5-3份搅拌混匀，得到第一混合物。

17、进一步的，步骤b所述的含羊膜间充质干细胞因子乳液中包括以下重量份的原料：羊膜间充质干细胞因子7-12份、emulium mellifera mb（聚甘油-6二硬脂酸酯、霍霍巴脂类、聚甘油-3蜂蜡酸酯、鲸蜡醇） 1-3份、emulcire 61 wl 2659 cg mb（鲸蜡醇、鲸蜡醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-20）0.25-1份、c10-c18脂酸甘油酯类1.5-6份、葵二酸二乙基乙酯1.5-5份、辛酸/葵酸甘油三酯3-7份、牛油果树果脂0.5-2份、辛基十二醇肉豆蔻酸酯2.5-7份、聚甲基倍半硅氧烷0.5-3份、欧洲白蜡树树皮提取物0.5-3份、丙二醇2.5-8份、甘油2.5-8份。

18、第二方面、一种如上所述的含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液的应用，应用为将所述组合物添加到化妆品中，制备得到的含羊膜羊膜间充质干细胞细胞因子乳液。

19、进一步的，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜中的一种或多种

20、本发明所采用的技术方案具有以下有益效果：

21、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明人羊膜间充质干细胞(humanamniotic mesenchymal stem cells，简称hamscs)，采用无血清培养基与用含有胎牛血清培养间充质干细胞相比，具有无其他动物源性、来源广泛、不受伦理限制及低免疫原性等优越性。

22、本发明所提供的一种含羊膜间充质干细胞细胞因子乳液的制备方法，所用的羊膜间充质干细胞来源于人羊膜，利用该方法生产得到的乳液具有减皱和保湿及抗氧化等组织修复的效果，操作简单，可规模化生产。

23、本发明促进皮肤新陈代谢，提升表皮分化、再生的功效，通过表皮的分化再生，促进皮肤本身“微生态”的快速建立，在皮肤组织修复及恢复皮肤屏障功能方面表现优异。