达托霉素纳米制剂及其制备方法和应用

本发明涉及一种达托霉素纳米制剂及其制备方法和应用，属于药物。

背景技术：

1、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，主要以滑膜增生关节结构破坏、免疫细胞浸润以及血管翳形成为病理特征，其发病部位可涉及全身滑膜关节。ra患病率为一般人群的0.5-1%，女性患病率是男性患病率的2-3倍，可发生于任何年龄，但患者年龄多集中在22-55岁，也可见于儿童，我国ra的发病率约为总人口的0.42%，全国大约有500多万ra患者。早、中期ra患者关节常有红肿疼痛伴有功能损害，晚期关节会出现不同程度的僵硬畸形，甚至可能致残疾。ra是一种多因素引起的疾病，包括遗传、环境、感染、内分泌失调、免疫调节失衡等因素，其中免疫调节失衡是ra主要的发病原因。

2、目前，ra并不能根治，临床ra的治疗目标是达到疾病缓解或低疾病活动度，即达标治疗，最终目的为控制病情、减少致残率，改善患者的生活质量。因此，研发更加安全有效的药物，可以解决未满足的临床需求，从而使患者获益。

3、达托霉素(daptomycin, dap)是由玫瑰孢链霉菌产生的次级代谢物，于2003年被美国食品药品监督管理局批准用于严重皮肤感染的治疗。研究表明dap除具有优异的抗菌活性外，还具有免疫调节作用。我们前期通过体内外炎症模型最早开展了dap对ra的治疗效应研究，结果表明，dap对胶原诱导的ra小鼠有较好的治疗效果，相关研究成果在cn110604808a达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用中有记载。鉴于ra的主要病理损伤发生在关节部位，尤其发病后期出现软骨破坏和骨侵蚀，严重影响患者活动能力。因此，将药物定向输送到关节病变部位能产生更好的抗ra疗效，然而目前还没有dap靶向纳米制剂。

4、常规治疗ra的药物由于全身分布，剂量增多引起正常组织和器官的损害以及治疗耐受性。纳米药物的出现改善了常规药物的不足，纳米载体将常规治疗ra药物装载在内，输送至病变部位。但纳米颗粒的免疫清除仍是药物递送的巨大障碍，如何避免免疫系统的清除一直是研究人员需要解决的问题。近年来，关于仿生功能化纳米颗粒的研究越来越多，因为仿生纳米颗粒结合了纳米材料的多变灵活性和天然材料的生物活性的特点，具有长效循环、主动靶向的功能以及避免免疫清除使得其成为研究的热点。细胞膜作为最受关注的一类仿生纳米载体，在ra中，目前已有研究将红细胞、血小板、巨噬细胞、中性粒细胞等的细胞膜制成纳米囊泡，包裹纳米颗粒，在ra动物模型中评价其药效。

5、关节骨破坏是ra患者后期重要的病理特征，破骨细胞在骨代谢中发挥着重要的骨吸收作用，参与破骨细胞分化、成熟、激活过程的最重要的两个因子是巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，m-csf)与核因子κb受体激活蛋白配体(receptoractivator of nf-κbligand，rankl)，rankl与其受体rank结合激活下游信号通路，最终导致破骨细胞的形成，而rankl在ra中高表达。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种达托霉素纳米制剂的制备方法。

2、为达到本发明的第一个目的，所述达托霉素纳米制剂的制备方法包括：

3、a.将聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹达托霉素得到纳米粒子nps；

4、b.将所述过表达rank的细胞膜囊泡和纳米粒子nps混匀，在水浴超声条件下超声3min～5min，然后依次挤压过800nm，400nm和200nm的聚碳酸酯膜，获得达托霉素纳米制剂；

5、所述过表达rank的细胞膜囊泡的膜蛋白与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比值为0.25。

6、在一种具体实施方式中，a步骤所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、达托霉素的质量比为7.5～15：1。

7、在一种具体实施方式中，a步骤所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、达托霉素的质量比为10：1。

8、在一种具体实施方式中，a步骤所述纳米粒子nps的制备方法包括：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于氯仿中得到溶液a，达托霉素溶于甲醇中得到溶液b，将溶液a和溶液b混匀作为油相，并向其中加入pva水溶液作为外水相，20%～30%功率超声乳化成外观均匀的乳液，随后，立即减压旋蒸，挥去有机溶剂，得载药乳液，然后离心收集沉淀纳米粒即得；所述外水相和油相的体积比例为3～6:1，所述pva水溶液中pva与水的质量体积比为0.25g～1g:100ml。

9、在一种具体实施方式中，所述pva的水溶液中pva与水的质量体积比为0.5g:100ml，超声的功率25%，外水相和油相的体积比例为4:1。

10、在一种具体实施方式中，所述离心的条件为12000～13000 rpm条件下，2～4℃低温离心50～60分钟。

11、在一种具体实施方式中，所述过表达rank的细胞膜囊泡的制备方法包括：用rank重组质粒转染293t细胞，建立rank过表达的293t细胞系，再提取过表达rank的细胞膜囊泡；所述rank重组质粒为插入rank基因片段的质粒。

12、质粒可以购买商业化的质粒，例如pfv155-gfp-puro质粒，将rank基因插入到pfv155-gfp-puro质粒的ecori和xbai酶切位点之间，构建pfv155-gfp-puro-rank重组质粒。

13、rank基因片段为能表达核因子κb受体激活蛋白受体的基因，例如gi号为:1519243924的基因片段能表达核因子κb受体激活蛋白受体，可作为rank基因片段。

14、在一种具体实施方式中，所述建立rank过表达的293t细胞系的方法包括：将重组质粒、包装质粒pspax2和pmd2.g以2:2:1的质量比例，通过pei转染试剂转染293t细胞，转染48～72h后，收集含慢病毒的培养上清液，用0.45μm滤器过滤后，将含慢病毒的上清液加入到新的293t细胞中感染48h后换液，并加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，最后得到稳定的rank过表达的293t细胞系。

15、在一种具体实施方式中，所述提取过表达rank的细胞膜囊泡的方法包括：

16、用4℃预冷的pbs清洗细胞，离心弃上清，把添加了苯甲基磺酰氟的细胞膜蛋白抽提试剂加入至细胞中，充分混匀并悬浮细胞，冰浴放置10～15分钟，再匀浆30～50次，将细胞悬液2～4℃，700g离心10分钟，收集上清液再2～4℃，14000～15000g离心35～40分钟；

17、添加了苯甲基磺酰氟的膜蛋白抽提试剂和细胞的比为1ml：2000～5000万个细胞。

18、本发明的第二个目的是提供一种达托霉素纳米制剂。

19、为达到本发明的第二个目的，所述达托霉素纳米制剂从里到外依次为达托霉素-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-过表达rank的细胞膜囊泡。

20、在一种具体实施方式中，所述过表达rank的细胞膜囊泡的膜蛋白与聚乳酸-羟基乙酸共聚物重量比值为0.25。

21、在一种具体实施方式中，所述达托霉素纳米制剂采用上述的达托霉素纳米制剂的制备方法制备得到。

22、在一种具体实施方式中，所述达托霉素纳米制剂的粒度范围为159.9±1.5nm，电位为-32.43±2mv。

23、在一种具体实施方式中，所述达托霉素纳米制剂为静脉给药制剂或关节腔注射制剂。

24、本发明的第三个目的是提供一种达托霉素纳米制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用，所述达托霉素纳米制剂为上述的达托霉素纳米制剂。

25、有益效果：

26、1.本发明的制备方法成功的制备得到靶向类风湿关节炎的达托霉素纳米制剂。

27、2.本发明制备得到的达托霉素纳米制剂稳定性好。

28、3.本发明的达托霉素纳米制剂具有良好的抗ra疗效，相比dap单独治疗，仿生纳米制剂提高了药效，减少了给药次数，缩短了给药周期，具有良好的应用前景。