无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片

1.无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，包含一个微井部(4)；微井部(4)包括自上而下的通孔阵列层(17)和衬底层(18)；通孔阵列层(17)上具有i*j个用于单个细胞捕获的上下贯通的通孔(9)，通孔阵列层(17)底部与衬底层(18)上表面紧密贴合；衬底层(18)上表面暴露在每个通孔(9)中的部分均固定有大规模用于捕获细胞转录组mrna的核苷酸序列，且同一通孔(9)对应的所有核苷酸序列中均带有一段代表该通孔位置信息的二维细胞编码序列，同一通孔(9)的二维细胞编码序列段相同，不同通孔(9)则不同，实现单细胞转录组溯源和单细胞位置溯源；使用固相捕获的方式，彻底突破细胞和微珠在捕获以及配对时的随机性。

2.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，微井部(4)包括自上而下的通孔阵列层(17)和衬底层(18)，其特征在于，通孔阵列层(17)和衬底层(18)分立加工并组合，或者一体成型。

3.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，微井部(4)的衬底层(18)上表面暴露在通孔阵列层(17)每个通孔(9)中的部分均固定有用于捕获细胞转录组mrna的核苷酸序列，该核苷酸序列通过微通道部a(2)、微通道部b(3)的辅助进行固定；所述微通道部a(2)底部具有i条平行凹槽(8)，即与通孔阵列层(17)通孔(9)行数相同，凹槽(8)底部开放，使用时通道部a(2)底部与通孔阵列层(17)的上表面贴合，且每一条平行凹槽(8)开放的底部与通孔阵列层(17)i行通孔(9)的每一行相对准，从而形成i个平行流道(19)，从而使得流经平行流道(19)中的核苷酸序列能够进入其下方覆盖的通孔(9)，且这些核苷酸序列能够被固定于衬底层(18)暴露在通孔(9)中的区域；所述微通道部b(3)底部具有j条平行凹槽(12)，即与通孔阵列层(17)的通孔(9)列数相同，平行凹槽(12)底部开放，使用时微通道部b(3)底部与通孔阵列层(17)顶部贴合，且每一条平行凹槽(12)开放的底部与通孔阵列层(17)j列通孔(9)的每一列相对准，从而形成j个平行流道(20)；平行流道(20)中的核苷酸序列能够进入其下方覆盖的通孔(9)并与通孔(9)底部已经固定的核苷酸序列相连；至此，每个通孔(9)底部暴露的衬底层(18)的区域形成了带有二维细胞编码序列的用于捕获mrna的核苷酸序列；

4.根据权利要求3所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，微通道部a(2)、微通道部b(3)，其使用时配合有一个真空盖部(1)；所述真空盖部(1)为具有无底空腔(23)的长方体结构，无底空腔上方连接抽气通孔(5)并延伸至真空盖部(1)的上表面；所述真空盖部(1)的下表面在使用时与所述微通道部a(2)或所述微通道部b(3)的上表面完全贴合，且其无底空腔(23)的底部开口完全覆盖所述微通道部a(2)的出口通孔(7)或所述微通道部b(3)的出口通孔(11)；当所述真空盖部(1)分别用于微通道部a(2)或微通道部b(3)时，通过抽气通孔(5)形成负压，可使得加载于i个入口通孔(6)的核苷酸序列流入平行流道(19)并从出口通孔(7)流出，或使得加载于j个入口通孔(10)的核苷酸序列流入平行流道(20)并从出口通孔(11)流出。

5.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，进行细胞捕获和换液时，使用封闭式流道结构，其构造如微通道部(13)；所述微通道部(13)具有底部开放且覆盖通孔阵列层(17)的细胞通道(16)，细胞通道(16)连接有贯通至微通道部(13)上表面的细胞入口(14)和细胞出口(15)；使用时所述微通道部(13)下表面与微井部(4)上表面完全贴合，通过细胞入口(14)注入细胞通道(16)中的细胞悬液在静止一段时间后，其中的细胞在重力作用下沉降入通孔(9)中，从而实现单个细胞在通孔(9)中的捕获；所述细胞通道(16)为单一的宽通道结构，通过增加内部分隔墙体(24)将其划分具有i条平行流道的并行流道(25)结构用于加强支撑和限制细胞，分隔墙体高度与细胞通道(16)深度相同；所述微通道部(13)下表面与微井部(4)上表面完全贴合时，第1至第i条并行流道(25)分别覆盖于所述通孔阵列层(17)的第1至第i行通孔(9)的上方，每个分隔墙体下表面正好与相邻两行微孔间的上表面区域贴合；向细胞入口(14)中通入的细胞悬液分别流入i条并行流道(25)并在静止一段时间后通过重力作用下沉降入通孔(9)中，从而实现单个细胞在通孔(9)中的捕获。

6.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，进行细胞捕获和换液时采用开放式捕获结构(21)；所述开放式捕获结构(21)为一个长方体，其上具有上下贯通且能够完全覆盖微井部(4)上通孔阵列层(17)所有通孔(9)的贯通溶液池(22)；将开放式捕获结构(21)的底面与通孔阵列层(17)上表面贴合，使得贯通溶液池(22)完全覆盖通孔阵列层(17)的所有通孔(9)后，将单细胞悬液滴入贯通溶液池(22)中，细胞在重力作用下沉降入底部的通孔(9)中，完成单细胞的捕获。

7.按照权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，所述微井层(4)对细胞mrna进行捕获以及空间编码后，先在通孔(9)底部进行逆转录，生成带有单细胞基因信息和位置信息的长cdna序列；之后对序列进行收集，经过扩增、测序、数据分析步骤，完成转录组测序。

8.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，通孔(9)阵列i、j的取值根据需求改变，i、j的取值相等或不相等；i*j即为该微流控芯片一次分析可处理的细胞数量。

9.根据权利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，微井部(4)上通孔阵列层(17)的每个通孔(9)直径和深度优选细胞直径的1.2-1.8倍。

10.根据专利要求1所述的无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，所述的真空盖部(1)、微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)的材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶、聚二甲基硅氧烷；所述微井部(4)的材料包括su-8光刻材料、玻璃；当采用聚二甲基硅氧烷pdms加工所述真空盖部(1)、微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)时，采用倒膜工艺实现，一步成型，具体工艺过程如下：