无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片

本发明属于空间转录组学与微流控芯片技术结合的，具体涉及一种无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片。

背景技术：

1、细胞作为生命活动的基本单位，是生命科学领域的重点研究对象，为了对细胞的基因表达进行分析，单细胞转录组测序技术应运而生。单细胞mrna测序技术能够揭示细胞之间的异质性，对单个细胞进行分析，避免单个细胞表达的异质性信息被掩盖，被广泛应用于肿瘤研究、神经生物学、临床诊断、胚胎学、病毒感染、植物组织研究等领域。

2、tang等人在2009年首次发明单细胞rna测序(scrna-seq)方法后，随着科学家对单细胞分离策略的研究和微流控技术的发展，在过去的十年内，单细胞转录组测序的应用规模极速扩大，以指数级别增长。evan z macosko等人发明了一种基于液滴的微流控系统，运用油包水的结构将单个细胞和单个条形码微珠进行封装，实现了单细胞隔离和测序，具有高通量低成本的优点。但由于基于液滴的封装具有高度随机性，服从双泊松分布，无法保证每个液滴中正好包含一个细胞与一个微珠，导致条形码微珠与细胞的配对效率较低。大量的空液滴、只包含一个微珠或只包含一个细胞的液滴不具备测序价值，造成了大量细胞和试剂的浪费，尤其不利于对珍贵细胞的分析。moon等人对该基于液滴的微流控系统进行了改进，通过重新设计原始滴注方法、引入外围设备的方式，对条形码微珠的损失问题进行了优化，但其细胞与微珠的配对仍较为随机被动，配对率受到限制，无法处理低输入样本。且由于引入了外围设备，其芯片的灵活性与便携性受到了限制。除了基于液滴的封装策略外，基于微井的微珠细胞配对策略也得到了广泛的应用。yin k等人开发的一种基于微井的well-paired-seq微流控芯片，运用双井结构和局部准静态流体力学原理，在重力作用下对细胞和微珠进行捕获配对，提高了细胞利用率和细胞微珠配对的效率，但该方法仍属于被动捕获策略，受到双泊松分布的限制。hapohl于1951年针对介电泳现象进行了研究，并将介电泳方法与基于微井的微流控系统进行结合，通过对芯片加电的方式，使得芯片微流道中产生不均匀电场，从而对微流道中的细胞施加介电泳力，影响细胞在芯片中的运动轨迹，对细胞进行主动介电泳捕获。该方法在细胞捕获层面突破了泊松分布，提高了细胞的捕获效率。但由于此方法中微珠仍采用被动捕获形式，服从高度随机的泊松分布，微珠和细胞配对效率仍有较大的提升空间。

技术实现思路

1、针对以上技术的不足和限制，本发明的目的为提供一种无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片。该方法不采用微珠与细胞封装或者配对的方式，舍弃了利用微珠上携带的条形码编码信息对单个细胞进行标记的方式，而是将核苷酸序列与微井部(4)的衬底层(18)上表面暴露在每个通孔(9)中的部分进行固相连接，并借助连接的核苷酸序列对细胞中释放的mrna进行固相捕获和标记。与现有技术相比，本发明设计的芯片彻底摆脱了泊松分布的限制，配对效率得到了大幅度的提高；可以对i*j个细胞进行并行处理，具有高通量的优势；利用二维细胞编码序列代替昂贵的微珠耗材，降低了成本；进行细胞捕获时，细胞在重力作用下沉积到通孔(9)底部完成单细胞的分离，而不需要其他外围设备，提升了系统的便携性和实用性。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括一个微井部(4)。

4、如图1所示，所述微井部(4)由上方的通孔阵列层(17)和下方的衬底层(18)构成，两层之间紧密贴合。通孔阵列层(17)和衬底层(18)可以分别加工后再进行组合，也可以直接一体化加工，一步成型。通孔阵列层(17)上具有i*j个上下贯通的通孔(9)，其大小正好可以容纳一个单细胞，用于单细胞的捕获，完成单细胞的分离。通孔阵列层(17)和下方的衬底层(18)贴合后，部分衬底层(18)会暴露在通孔(9)底部，这部分暴露的衬底层(18)上均固定有大规模用于捕获细胞转录组mrna的核苷酸序列，这些核苷酸序列上都带有二维细胞编码序列。同一通孔(9)底部的衬底层(18)上固定的核苷酸序列所带有的二维细胞编码序列段相同，不同通孔(9)底部的衬底层(18)上固定的核苷酸序列所带有的二维细胞编码序列段则不同，可以代表通孔的位置信息，从而对单细胞转录组和单细胞空间位置进行溯源。

5、如图2所示，通孔(9)底部的衬底层(18)上的核苷酸序列通过微通道部a(2)、微通道部b(3)进行辅助固定。微通道部a(2)上具有i个入口通孔(6)和i个出口通孔(7)，i个入口通孔(6)和i个出口通孔(7)之间连接有i条位于微通道部a(2)底部的平行凹槽(8)，与通孔阵列层(17)通孔(9)行数相同。微通道部b(3)上具有j个入口通孔(10)和j个出口通孔(11)，j个入口通孔(10)和j个出口通孔(11)之间连接有j条位于微通道部b(3)底部的平行凹槽(12)，与通孔阵列层(17)通孔(9)列数相同。

6、如图3-5所示，配合使用真空盖部(1)、微通道部a(2)与微通道部b(3)、微井部(4),可以进行核苷酸序列的固定。位于微通道部a(2)与微通道部b(3)底部的平行凹槽(8)和平行凹槽(12)底部为开放结构。将每一条平行凹槽(8)开放的底部与通孔阵列层(17)i行通孔(9)的每一行相对准，对准后将通道部a(2)底部与通孔阵列层(17)的上表面进行贴合，即可形成i个平行流道(19)。借助于真空盖的辅助，使得核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)从入口通孔(6)流经平行流道(19)，从出口通孔(7)流出，核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)能够进入通孔并固定于衬底层(18)暴露在通孔(9)中的区域。将每一条平行凹槽(12)开放的底部与通孔阵列层(17)j列通孔(9)的每一列相对准，对准后将通道部b(3)底部与通孔阵列层(17)的上表面进行贴合，即可形成j个平行流道(20)。借助于真空盖的辅助，使得核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)从入口通孔(6)流经平行流道(19)，从出口通孔(7)流出，核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)能够进入通孔，并与固定于衬底层(18)上的核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)连接。

7、如图6所示，真空盖部(1)是一个内部具有无底空腔(23)的长方体结构，其上表面具有一个贯穿顶层的抽气通孔(5)，真空盖部(1)可以与微通道部a(2)与微通道部b(3)、微井部(4)配合使用，进行核苷酸序列的固定。将真空盖部(1)的底部开口完全覆盖住出口通孔(7)与出口通孔(11)，利用抽气通孔(5)在出口处形成负压，加载于入口通孔(6)的核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)与加载于入口通孔(10)的核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)会在负压作用下，分别流入并充满平行流道(19)和平行流道(20)，分别从出口通孔(7)与出口通孔(11)流出。

8、如图7所示，用于固相捕获mrna的核苷酸序列由核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)、核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)组成。其中核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)包含一段pcr引物(pcrprimer)、一段随机二维细胞编码序列a(spatial barcode)、一段特异性分子标签(umi)，以及一个连接手柄(ligation linker)。其中pcr引物用于后续的pcr扩增，随机核苷酸序列a用于构造空间位置条码，特异性分子标签(umi用于防止多轮扩增后出现无法明确原始基因表达量的问题，连接手柄用于将核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)、核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)进行连接。核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)包含一个连接手柄(ligation linker)、一段随机二维细胞编码序列b(spatial barcode)、以及一段oligo(dt)。其中连接手柄用于在t4连接酶的作用下将核苷酸序列(a1、a2、a3……至ai)、核苷酸序列(b1、b2、b3……至bj)连接，随机核苷酸序列b用于与随机核苷酸序列a配合，构造二维细胞编码序列，oligo(dt)用于与mrna末尾的poly(a)连接，进行mrna捕获。

9、如图8所示，进行细胞捕获和换液操作时，可以采用微通道部(13)进行辅助。微通道部(13)为一个封闭式流道结构，具有贯通的细胞入口(14)和细胞出口(15)，位于芯片中心部位的与芯片长边平行的i条凹槽作为连接细胞入口(14)和细胞出口(15)之间的细胞通道(16)，其条数与通孔阵列层(17)通孔(9)行数相同。每条细胞通道(16)在流道深度方向上的投影可以完全覆盖一行通孔(9)，沿芯片长边平行排列的各行通孔(9)分别被分隔于不同的微流道(16)中。

10、如图9-10所示，微井部(4)表面形成核苷酸序列网格状阵列后，将微通道部(13)与微井部(4)对准，使得第1至第i条并行流道(25)分别覆盖于所述通孔阵列层(17)的第1至第i行通孔(9)的上方，每个分隔墙体下表面正好与相邻两行微孔间的上表面区域贴合。向细胞入口(14)中通入细胞悬液，细胞悬液会充满细胞通道(16)。利用升降台调节细胞通道(16)中的压强使得细胞悬液在细胞通道(16)静止，保持一段时间后，细胞会在重力作用下沉降入通孔(9)中。每个通孔(9)底部大小能够正好容纳一个细胞，沉降后的单个细胞被分隔于不同的通孔(9)之中，实现单细胞的分离与捕获。芯片工作在裂解模式时，将冻融化裂解缓冲液从细胞入口(14)注入细胞通道(16)，使得细胞通道(16)中充满冻融化裂解缓冲液，再停止注入冻融化裂解缓冲液。再将氟化油从细胞入口(14)注入细胞通道(16)，待到细胞通道(16)中充满氟化油后再停止注入，从而对通孔(9)进行密封，防止通孔(9)之间的交叉污染。之后将芯片先在-80摄氏度环境下或者在干冰/乙醇浴中冷冻5分钟，再在室温环境下解冻5分钟，并循环上述冷冻-解冻三次，使得细胞裂解。裂解完成后，将芯片静置1小时，使得细胞裂解释放出的mrna被通孔(9)底部的核苷酸序列捕获标记。后续进行提取、逆转录、pcr扩增、测序等工作，得到基因文库数据。

11、如图11所示，进行细胞捕获和换液时除了可以使用封闭式流道结构进行辅助之外，也可以采用开放式捕获的形式，开放式捕获需要借助贯通溶液池(21)辅助完成。贯通溶液池(21)为一个中部有一个大直径通孔(22)的长方体结构，其上的大直径通孔(22)能够完全覆盖微井部(4)上通孔阵列层(17)所有通孔(9)。将贯通溶液池(21)与通孔阵列层(17)顶部对准，使得大直径通孔(22)完全覆盖微井部(4)上通孔阵列层(17)所有通孔(9)后，进行贴合。将单细胞悬液滴入大直径通孔(22)中，静置一段时间，细胞会在重力作用下沉降入底部的通孔(9)中，完成单细胞的捕获与分离。

12、所述微通道部a(2)、微通道部b(3)采用绝缘透明材料聚二甲基硅氧烷(pdms)运用倒模工艺实现,微井部(4)采用su8材料制成，加工流程如图12所示，具体工艺过程如下：

13、(1)模具的加工:将su-8旋涂于硅片衬底上，进行匀胶、前烘、曝光、后烘、显影、坚模等步骤，运用光刻技术分别制备成一体化微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)所需的模具；

14、(2)在微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)所需的模具表面加热固化一层pdms聚合材料，将这一结构整体从模具上揭下，并用针咀在出入口处打孔，形成微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)；

15、(3)在玻璃衬底表面旋涂su-8光刻材料进行光刻，经过匀胶、前烘、曝光、后烘、显影、坚模等步骤后，得到微井部(4)；

16、(4)在显微镜下将微通道部a(2)、微通道部b(3)、微通道部(13)分别与微井部(4)贴合对准，使得通孔(9)被微流道覆盖，进行后续操作。

17、与现有的单细胞测序技术相比，本发明的有益效果如下：

18、本发明提供的一种无需编码微珠配对的高通量单细胞转录组测序微流控芯片，芯片采用微流道与微井层贴合的方式，将核苷酸序列通入微通道并与通孔底部共价连接，形成核苷酸序列网格状阵列，得到空间位置信息。通过通孔接收在重力作用下沉积掉落的单个细胞，实现单个细胞的捕获、分离。通入冻融裂解液使得细胞裂解之后，细胞中的mrna与微井中的核苷酸序列连接，进行后续的提取、逆转录、pcr扩增、测序工作，最终得到测序文库。

19、与现有技术相比，本发明设计的芯片不采用传统的细胞与微珠共封装配对的方式，而是创新性地将核苷酸序列与微井层上的通孔底部进行固相共价连接，运用核苷酸序列代替传统方法中的微珠。细胞在重力作用下沉积到微井中完成单细胞分离，并通入冻融裂解液进行细胞裂解之后，微井中固相连接的核苷酸序列可以对细胞中的mrna进行固相捕获，从而对mrna进行标记。这种方式彻底摆脱了泊松分布的限制，提高了配对效率，并且可以并行处理i*j个细胞，且无需微阀微泵等外围设备，具有高效率、高通量、便携的优势。本发明使用组合条形码策略，生成i×j个无需解码的核苷酸序列只需要i+j种不同的核苷酸序列，大大减少了所需的核苷酸序列种类，显著减少了试剂的浪费，节约了所需成本。