一种脐带间充质干细胞制备方法与流程

本发明涉及干细胞制备领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞制备方法。

背景技术：

1、干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的脐带、脐带血、乳牙、骨髓、脂肪、肝中。其中脐带来源的间充质干细胞因为来源广泛，采集比较方便，提取制备的细胞细胞活率高，细胞表型稳定，具备较高的临床应用价值。因此，研究脐带间充质干细胞制备方法具有重要意义，现有的相关制备方法获得的制剂样品，在冷冻保存过程中，细胞活率有待改善。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种脐带间充质干细胞制备方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种脐带间充质干细胞制备方法，所述方法包括以下步骤：

3、(1)取健康良好脐带经贴壁法培养人脐带间充质干细胞，传代至p4～p6代后，胰酶替代物或胰蛋白胨酶消化物消化，清洗；

4、(2)将清洗后的人脐带间充质干细胞加入培养基复合液中，细胞密度为2～10×105/ml；

5、(3)流式检测细胞表型cd73、cd90、cd105，收集表达率＞95％的人脐带间充质干细胞；

6、(4)进行热循环试验3～6次，每次热循环程序包括1～10℃下保持50～70分钟，24(±2)～26(±2)℃下持续50～70分钟，流式细胞术检测细胞存活率及细胞表型变化，收集cd73、cd90、cd105表型＞90％的人脐带间充质干细胞；

7、(5)2～8℃条件下放置12～15小时，流式细胞术检测细胞存活率，收集存活率＞90％的人脐带间充质干细胞；

8、(6)将制剂置于2～5℃稳定性保存箱内，光照强度调整为4000～5500lux，光照6～8小时，收集存活率＞85％的人脐带间充质干细胞群；

9、(7)冷冻储存。

10、上述脐带间充质干细胞制备方法选择恰当的传代细胞和细胞密度，依次结合热循环试验、2～8℃条件下放置、2～5℃光照处理后，收集特定的细胞群后，制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

11、优选地，所述步骤(2)中，细胞密度为3～8×105/ml。

12、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

13、优选地，所述步骤(4)中，进行热循环试验4～5次。

14、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

15、优选地，所述步骤(4)中，25(±2)℃下持续50～70分钟。

16、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

17、优选地，将制剂置于3.5～4.5℃稳定性保存箱内，光照强度调整为4000～5500lux，光照6～8小时。

18、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

19、优选地，将制剂置于3.5～4.5℃稳定性保存箱内，光照强度调整为4500～5100lux，光照6～8小时。

20、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

21、优选地，胰蛋白胨酶消化物的cas号为91079-40-2。

22、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

23、优选地，所述步骤(1)中，用0.08～0.12mol/l的ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗。

24、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

25、优选地，所述培养基复合液包括dmem和fbs，fbs在培养基复合液中的体积比例为5％～10％。

26、上述脐带间充质干细胞制备方法制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

27、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种脐带间充质干细胞制备方法，本发明脐带间充质干细胞制备方法选择恰当的传代细胞和细胞密度，依次结合热循环试验、2～8℃条件下放置、2～5℃光照处理后，收集特定的细胞群后，制备得到的脐带间充质干细胞，冷冻保存时间长，冷冻保存后存活率更高。

1.一种脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，细胞密度为3～8×105/ml。

3.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，进行热循环试验4～5次。

4.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，25(±2)℃下持续50～70分钟。

5.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，将制剂置于3.5～4.5℃稳定性保存箱内，光照强度调整为4000～5500lux，光照6～8小时。

6.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，将制剂置于3.5～4.5℃稳定性保存箱内，光照强度调整为4500～5100lux，光照6～8小时。

7.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，胰蛋白胨酶消化物的cas号为91079-40-2。

8.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，用0.08～0.12mol/l的ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗。

9.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述培养基复合液包括dmem和fbs，fbs在培养基复合液中的体积比例为5％～10％。