基于多酶恒温扩增结合CRISPR-Cas12a可视快速鉴定松茸方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学检测，具体涉及一种基于多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification，mira)结合crispr-cas12a可视化快速鉴定松茸的方法及其试剂盒。

背景技术：

1、松茸，学名松口蘑(tricholoma matsutake)，是松栎等树木外生的菌根真菌，具有独特的浓郁香味，被誉为“菌中之王”。现代科学研究数据显示松茸富含蛋白质，有18种氨基酸，14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸，核酸衍生物，肽类物质等稀有元素。另含有3种珍贵的活性物质：双链松茸多糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质——松茸醇，是世界上最珍贵的天然药用菌类。

2、松茸主要产于东北地区以及云贵川三省交界一带海拔较高的林区，野生菌松茸符合联合国粮农组织和世界卫生组织开发三原则——天然、营养、保健，在国际市场上长期受到追捧，价格居高不下，其经济价值日益突显。中国是松茸的主要出口国，每年出口大量的优质松茸到欧洲和日本。同时，松茸已被列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》(1999)，为国家二级保护野生植物，如需进出口松茸等国家野生保护植物，需取得国家濒危物种管理机构出具的允许进出口证明书，并主动向海关申报。非法进出口野生植物的，由海关依照海关法的规定依法予以处罚。

3、基于松茸的高营养价值及高经济价值，在国际贸易和市场流通领域易成为食品掺假的目标，市场上销售的松茸及其制品鱼龙混杂、真假难辨，急需开发快速、灵敏的真伪鉴别方法。目前松茸的检测主要依赖形态识别法，但形态识别法不能有效识别松茸加工产品。而以液相气相为代表的理化检测所要求的实验条件较高，检测时间较长，难以实现松茸快速检测。基于dna检测的分子生物学方法则体现出了明显的优势，但目前常规采用的荧光定量pcr技术和基于扩增子测序的dna条形码检测技术均依赖高级别分子生物学实验室和高端的仪器设备，无法满足现场快速检测的实际场景需求。

技术实现思路

1、本发明针对松茸源性成分现场快速检测的难题，提供一种反应快速、灵敏度高、特异性强、结果便于观察、不依赖昂贵复杂仪器的松茸源性成分可视化检测方法及其试剂盒。为此，本发明基于crispr的特性，开发了一种快速准确的检测方法，用于对松茸源性成分特异性靶序列进行检测。首先，对样品进行核酸提取，并在恒温条件下进行多酶恒温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification，mira)和crispr-crrna复合物结合并切割靶标dsdna，其激活ssdna的反式切割，与ssdna偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号，结合核酸侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，lfd)进行可视化检测，具有反应快速，特异性强，灵敏度高，结果便于观察，对操作人员要求低,不需要昂贵复杂仪器等特点，适用于松茸源性成分的现场快速检测。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒，包括以下组分：(1)阳性质粒；(2)mira干粉试剂反应管；(3)buffer a；(4)buffer b；(5)松茸pol基因的特异性crrna；(6)crispr蛋白；(7)ssdna报告系统；(8)胶体金试纸条；

4、所述mira干粉试剂反应管中装有含重组酶的反应液，所述含重组酶的反应液包括以下组分：

5、重组酶200ng/μl，单链dna结合蛋白220ng/μl，dna聚合酶100ng/μl，辅助蛋白80ng/μl，上游引物10μm，下游引物10μm；

6、所述上游引物序列如seq id no.1所示；所述下游引物序列如seq id no.2所示；

7、seq id no：1pol-f：5’-gaagaaggttgttacggtggagaaacacaacg-3’

8、seq id no：2pol-r：5’biotin-gtgcgtcggagataggactgtcgtcagcgaac-3’

9、所述buffer a包含一下组分：质量百分浓度3％的聚乙二醇，tirs 30mm；所述buffer b包括以下组分：280nm醋酸镁。

10、所述松茸pol基因的特异性crrna序列如seq id no.3所示；

11、seq id no：3pol-cr1：uuugcagauguaagguuggaucccaag

12、所述ssdna报告系统包含可用荧光pcr系统进行判读，序列如seq id no：10所示。

13、seq id no：10ssdna：5’6-fam/tttattt/3’bhq1

14、基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸方法，采用上述的基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒进行检测。

15、作为优选，上述基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸方法，包括以下步骤：

16、步骤a：利用基因组dna提取试剂盒进行待测样品dna提取；

17、步骤b：利用恒温扩增引物扩增待测样品dna：在mira恒温扩增体系中加入buffera和待测样品dna，进行mira等温扩增，39℃下反应20min，获得特异性产物；

18、步骤c：利用crispr检测体系识别切割松茸成分特异性核酸片段时：将步骤b获得的特异性产物加入crispr检测体系，于37℃反应10min；

19、步骤d：将核酸扩增产物用ddh2o补充至80μl，滴于胶体金试纸条加样孔中，15分钟内记录判读区检测结果。

20、本发明的优点：基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒可以利用胶体金试纸条进行现场可视化检测，并具有良好的特异性和灵敏性。基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸方法首次采用mira/crispr-cas12a特异性检测松茸成分，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作简便、不依赖大型实验仪器等优势。公开了一套用于松茸成分特异性核酸检测的crispr反应体系和特异性恒温扩增引物，方便用于松茸源性成分的现场快速检测。

1.基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：(1)阳性对照；(2)mira干粉试剂反应管；(3)buffer a；(4)buffer b；(5)松茸pol基因的特异性crrna；(6)crispr蛋白；(7)ssdna报告系统；(8)胶体金试纸条；

2.基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸方法，其特征在于，采用上述的基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒进行检测。

3.如权利要求2所述的基于多酶恒温扩增结合crispr-cas12a可视快速鉴定松茸方法，其特征在于，包括以下步骤：