一种生产四乙酰植物鞘氨醇的重组菌及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种生产四乙酰植物鞘氨醇的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、四乙酰植物鞘氨醇（tetra-acetyl phytosphingosine，taps）是植物鞘氨醇（phytosphingosine）的乙酰化产物。而植物鞘氨醇是一种长链的氨基醇，广泛存在于植物细胞膜中，具有独特的生物活性和化学稳定性。四乙酰植物鞘氨醇通过在植物鞘氨醇的羟基和氨基上引入乙酰基团，增强了亲脂性和稳定性。四乙酰植物鞘氨醇具有抗炎、抗氧化和调节细胞信号传导等生物活性，可用于研发新型药物，治疗皮肤病、神经系统疾病和心血管疾病等。四乙酰植物鞘氨醇良好的保湿、抗氧化和抗衰老性能，使其成为化妆品中常用的活性成分，可用于护肤霜、精华液和面膜等产品。作为一种天然的抗氧化剂和保湿剂，四乙酰植物鞘氨醇可用于食品保鲜和营养补充品中，延长食品保质期，提高营养价值。四乙酰植物鞘氨醇经过脱乙酰化处理后，可以转化为植物鞘氨醇，进而作为合成神经酰胺的前体物质，在神经酰胺的制备过程中扮演着重要角色。

2、随着人们对天然、绿色和健康的追求，四乙酰植物鞘氨醇的市场需求不断增长。目前四乙酰植物鞘氨醇的制备方法主要包括菌种发酵法，但是现有菌种由于产量较低，导致生产成本较高。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生产四乙酰植物鞘氨醇的重组菌及其构建方法和应用，通过对合成四乙酰植物鞘氨醇的关键蛋白进行不同来源基因的筛选获得了能够高产四乙酰植物鞘氨醇的重组菌。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明采用的taps的合成途径如图1所示。基于这一taps合成途径，从不同来源的鞘氨醇磷酸酶（lcb3）、丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱性亚基2（lcb2）和丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱性亚基1（lcb1）进行筛选，因此获得了一种高产taps的重组菌，该重组菌能够表达该合成途径的关键酶：lcb3、lcb2和lcb1，将其用于taps的生产，其具有较高的taps产量。

4、在本发明中，构建的重组菌的出发菌株是威克汉母西弗酵母菌（ wickerhamomyces ciferrii），该菌株于2023年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc no.27391。其为现有菌株，已在专利cn202410019615.2中公开。

5、上述威克汉母西弗酵母菌能够用于生产taps，但为了进一步提高taps的产量，本发明在研发过程中对合成taps的关键酶lcb3、lcb2和lcb1进行优化，结果发现不同来源的lcb3、lcb2和lcb1对taps产率有重要的影响。

6、对于lcb3，本发明从不同来源lcb3中筛选到5种产率相对更高的酶，分别为：来源于 botrytis cinerea的bclcb3（ncbi reference sequence：xm_024696698.1）、来源于 fusarium pseudograminearum的fplcb3（ncbi reference sequence：xm_009256063.1）、来源于 purpureocillium takamizusanense的ptlcb3（ncbi reference sequence：xm_047987418.1）、来源于 podospora pseudocomata的pplcb3（ncbi reference sequence：xm_062888877.1）、来源于 metarhizium acridum的malcb3（ncbi reference sequence：xm_007811787.2）。

7、经过密码子优化后的上述5种lcb3的核苷酸序列如seq id no.1-5所示。通过以上基因的优化，构建能够表达外源lcb3的重组菌，获得的重组菌能在出发菌株的基础上提高taps产量。

8、对于lcb2，本发明从不同来源lcb2中筛选到5种产率相对更高的酶，具体为：来源于 penicillium cosmopolitanum的pclcb2（ncbi reference sequence：xm_056631772.1）、来源于 aspergillus nidulans的anlcb2（ncbi reference sequence：xm_653614.2）、来源于 tuber melanosporum的tmlcb2（ncbi reference sequence：xm_002839585.2）、来源于 kazachstania barnettii的kblcb2（ncbi reference sequence：xm_041548502.1）、来源于 neurospora tetrasperma的ntlcb2（ncbi reference sequence：xm_009852915.1）。

9、经过密码子优化后的上述5种lcb2的核苷酸序列如seq id no.6-10所示。通过以上基因的优化，构建能够表达外源lcb3和lcb2的重组菌，获得的重组菌能在上述重组菌的基础上进一步提高taps产量。

10、对于lcb1，本发明从不同来源lcb1中筛选到5种产率相对更高的酶，具体为：来源于 rhizophagus irregularis的rilcb1（ncbi reference sequence：xm_025329453.2）、来源于 coprinopsis cinerea的cclcb1（ncbi reference sequence：xm_001837986.2）、来源于 suillus bovinus的sblcb1（ncbi reference sequence：xm_041455992.1）、来源于 trametes versicolor的tvlcb1（ncbi reference sequence：xm_008045601.1）、来源于 candida albicans的calcb1（ncbi reference sequence：xm_711183.1）。

11、经过密码子优化后的上述5种lcb1的核苷酸序列如seq id no.11-15所示。通过以上基因的优化，构建能够表达外源lcb3、lcb2和lcb1的重组菌，获得的重组菌相比前述出发菌和重组菌具有更高的taps产量。

12、上述重组菌的构建方法包括：将外源基因以同源重组的方式插入到出发菌株中，经诺尔斯菌素抗性筛选出重组菌。

13、在本发明中，插入出发菌株的基因是外源的lcb3、lcb2和lcb1的基因中的至少一种。

14、可选地，重组菌中包括外源的lcb3基因；或者外源的lcb3、lcb2基因；或者外源的lcb3、lcb2和lcb1基因。较为优选地，重组菌中包括外源的lcb3、lcb2和lcb1基因。

15、在一些实施例中，重组菌中包括pplcb3、pclcb2和sblcb1的基因。通过实验证明，pplcb3、pclcb2和sblcb1的组合能够使taps产量达到最高。

16、在一些实施例中，上述重组菌是通过构建重组自杀载体，将重组自杀载体转化到出发菌株后，然后再经过经诺尔斯菌素抗性筛选出重组菌。

17、其中重组自杀载体的构建方法包括：将lig4-up片段、gapdh启动子片段、诺尔斯菌素抗性标记nat1片段、lig4-down片段overlap pcr扩增获得lig4-up-gapdh-nat1-lig4-down同源重组片段，然后将lig4-up-gapdh-nat1-lig4-down同源重组片段与puc19线性载体ta克隆，获得puclig4重组自杀载体，该载体的核苷酸序列如seq id no.16所示。

18、进一步地，本发明在此基础上还提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。

19、将上述重组菌作为全细胞催化剂，其表达的外源lcb3、lcb2和lcb1能够高效地生产taps。

20、本发明还提供了上述重组菌在合成taps及其下游产物中的应用。基于此，本发明可用该重组菌生产taps，方法如下：将上述重组菌加入到反应体系中进行全细胞催化，获得taps。

21、在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行扩大培养，该扩大培养过程为：将重组菌接种至ypd液体培养基，在25-30℃、180-220rpm的条件下培养24-60h，获得种子液。

22、在一些实施例中，上述种子液可接种至摇瓶发酵培养基中，培养条件为：温度为25-30℃、转速为180-220rpm，发酵培养时间为36-60h。

23、在一些实施例中，上述重组菌可接种至发酵罐发酵培养基，培养条件为：温度为25-30℃，溶氧高于20%，添加80%的甘油补料，发酵培养时间为72-120h。

24、本发明具有以下有益效果：

25、本发明通过同源重组的方式在威克汉母西弗酵母菌的基因组中插入合成taps的关键基因，从而获得一种表达异源lcb3、lcb2和lcb1的重组菌。利用该重组菌生产taps能够提高taps的产量，缩短发酵周期，同时还能节约材料和能源，从而大幅降低了生产成本。因此本发明的重组菌以及生产taps的方法具有良好的工业化应用前景。