3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体、编码基因、载体及应用的制作方法

本发明涉及酶改造，具体为3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体、编码基因、载体及应用。

背景技术：

1、甲基泼尼松龙是二代甾体类糖皮质激素类药物，由强的松衍生而来，其生物活性是强的松的4倍左右。临床上应用广泛，常用于危重疾病的急救，比如白血病、休克、脑水肿、多发性神经炎、骨髓炎、及防止癌症化疗引起的呕吐等，还可用于内分泌失调、风湿性疾病、胶原性病、皮肤疾病、过敏反应、眼科疾病、胃肠道疾病、血液疾病等，市场前景广阔。

2、为了能够以最短路径获得高质量的甲泼尼龙，目前工业上主要采用化学-酶法合成甲泼尼龙，即经过多步化学、生物发酵步骤由氢化可的松等起始原料获得六甲格式物，再经1，2脱氢反应获得关键中间体，甲泼尼龙脱氢物，最终水解获得甲泼尼龙。其中一个关键的反应步骤是1，2位的脱氢反应。相比于化学脱氢工艺，酶法脱氢因效率高、无副产物积累、产物纯度高的优点备受青睐。因此，在甲泼尼龙的工业中，无论采用哪种反应路径，1，2位的脱氢反应都需要采用3-甾酮-δ1-脱氢酶(3-ketosteroid-δ1-dehydrogenase，kstd)来完成，kstd在甲泼尼龙的生产中的使用是不可或缺的。然而，kstd是一种膜蛋白酶，由于膜蛋白溶解性差，在其异源表达时多以包涵体的形式存在，这是kstd工业化应用上亟待解决的一个技术难题。与此同时，不同微生物来源的kstd酶对不同的甾体底物的专一性、活性均不同，归因于它们一级序列的差异性导致的三级结构的局部差异。因此，直接通过高通量筛选到易于过表达且活性较高的天然kstd难度较大，而直接对筛选到的活性高但可溶性表达水平低的kstd进行定向改造以提高其蛋白表达水平是相对可行的办法。

技术实现思路

1、本发明提供了3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体、编码基因、载体及应用，通过改造野生型pakstd酶得到活性较高的酶突变体，可用于酶催化制备甲基泼尼松龙脱氢物，推进酶催化制备甲泼尼龙脱氢物的工业进程。

2、有鉴于此，本发明的方案为：

3、本发明的第一个方面，提出氨基酸序列如seq id no：9、11～12所示的3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体。

4、本发明的第二个方面，提出编码上述第一个方面所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体的基因。

5、本发明的第三个方面，提出表达载体，该表达载体含有第二个方面所述的基因。

6、本发明的第四个方面，提出一种菌株，包含有第三个方面所述的表达载体。

7、进一步地，所述菌株为大肠杆菌。

8、本发明的第五个方面，提出3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体的生产方法，步骤包括：以第四个方面所述菌株进行培养，收集培养物得到3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体。

9、本发明的第六个方面，提出第一个方面所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体在制备甾体药物及甾体药物中间体中的应用。

10、进一步地，所述所述甾体药物中间体为甲基泼尼松龙脱氢物，以甲基泼尼松龙格氏物为底物进行c1，c2位脱氢反应制备得到。

11、本发明的第七个方面，甲基泼尼松龙脱氢物的制备方法，步骤包括：向甲基泼尼松龙格氏物溶液中加入乳化剂、ph缓冲溶液及第一个方面所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体进行混合，反应得到甲基泼尼松龙脱氢物。

12、进一步地，所述甲基泼尼松龙格氏物溶液所用溶剂为dmso。

13、进一步地，所述乳化剂为triton-x100。

14、进一步地，所述ph缓冲溶液为pbs。

15、进一步地，所述反应过程ph为7.5。

16、进一步地，所述反应过程温度为35℃。

17、进一步地，所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no：12所示。

18、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

19、本发明所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体催化活性高，应用于酶催化制备甲基泼尼松龙脱氢物具有反应体系简单温和，转化周期短，副反应少，成本低等优点，推广了酶催化制备甲基泼尼松龙中间体的工业应用。

1.氨基酸序列如seq id no：9、11～12所示的3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体。

2.编码权利要求1所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体的基因。

3.表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。

4.一种菌株，其特征在于，包含有权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

6.3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体的生产方法，其特征在于，步骤包括：以权利要求4所述菌株进行培养，收集培养物得到3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体。

7.权利要求1所述3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体在制备甾体药物及甾体药物中间体中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述甾体药物中间体为甲基泼尼松龙脱氢物，以甲基泼尼松龙格氏物为底物进行c1，c2位脱氢反应制备得到。

9.甲基泼尼松龙脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤包括：向甲基泼尼松龙格氏物溶液中加入乳化剂、ph缓冲溶液及权利要求1所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体进行混合，反应得到甲基泼尼松龙脱氢物。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述甲基泼尼松龙格氏物溶液所用溶剂为dmso；