光交联性墨水、3D打印制品、制备方法及应用与流程

本发明涉及3d打印，特别涉及光交联性墨水、3d打印制品、制备方法及应用。

背景技术：

1、组织工程旨在重建活体组织，替代受损或缺失的组织/器官，维持、恢复或增强活体的部分或整体器官功能。理想的组织工程支架是实现该目标不可或缺的组成部分。在自然组织中，细胞外基质(extracellular matrix,ecm)是细胞分泌的物质集合，起到为细胞提供空间和机械信号，为组织提供物理支持的作用。ecm不仅起到引导结缔组织内细胞排列的作用，而且具有限定细胞行为和组织功能的作用。因此，能够模拟ecm的支架是修复受损组织或器官的一种有效治疗策略。

2、3d打印技术是增材制造技术中的一种，结合计算机辅助设计(cad)或计算机断层扫描(ct)图像可进行精确的3d支架制备，在多孔或定制化结构成型方面具有独特的优势。目前，3d打印技术在组织工程领域得到了广泛的应用，例如，3d打印金属支架、3d打印高分子支架以及3d打印水凝胶支架等。相较于传统的加工技术，通过3d打印技术制备的支架可制备获得具有≤100μm级别的高精度，且孔径均一的三维支架，该三维支架有利于细胞均匀地长入。此外，3d打印技术的出现极大地减少了组织工程支架的制备时间，并且形貌高度匹配独立个体的受损部位。因此，3d打印技术有望发展为未来组织工程支架制备中不可或缺的一个环节。

3、胶原蛋白是一组具有特有纤维结构的蛋白，在维持ecm生物和结构完整性方面发挥着重要作用，并为组织提供物理支持。胶原蛋白来源广泛，如骨、软骨、肌腱、韧带、血管、神经、皮肤等来源，胶原蛋白是大多数硬组织和软组织的主要结构蛋白。此外，胶原蛋白免疫原性低，具有多孔结构、具有渗透性、具有良好的生物相容性和生物降解性，并具有调节细胞形态、粘附、迁移和分化的功能。这些优良的性能使胶原蛋白作为天然高分子材料成为组织工程中最有前途的一类生物支架材料。

4、i型胶原蛋白是ecm中含量最丰富的一类胶原蛋白，尤其是大量存在肌腱和骨组织中的ecm中。通常来说，组织中提取的胶原蛋白可以被归为两类：胶原分子(可溶解胶原蛋白)和胶原纤维(非可溶解胶原蛋白)。胶原纤维具有高耐水解性，在所有种类的胶原纤维中，i胶原纤维是唯一可以在蛋白不变性的条件下从组织中提取的胶原纤维。鉴于i型胶原蛋白的丰富资源和易提取性，目前i型胶原蛋白在大量的研究中被制备成组织工程支架，以提高细胞的粘附、迁移和增殖能力，达到促进受损组织修复的目的。

5、此外，i型胶原蛋白为高亲水性材料，因此可以作为水凝胶前驱物，如3d打印墨水，用于3d打印胶原蛋白支架。目前，3d打印胶原蛋白溶液通常采用温敏交联法。然而，该方法往往存在如下的一个或多个问题：交联所需时间长，容易导致结构皱缩，还可能导致支架结构坍塌；而且支架降解快，长期稳定性不佳；此外，打印性差，3d支架的结构精准性不佳(可参阅osidak eo,kozhukhov vi,osidak ms,domogatsky sp.collagen as bioink forbioprinting:acomprehensive review.int j bioprint.2020apr 21；6(3):270.)。

6、因此，有必要进一步开发用于3d打印的新材料。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的包括提供一种光交联性墨水，该光交联性墨水可作为3d打印墨水，打印性良好、交联速度快、交联后可在水溶液环境下维持稳定结构，经3d打印可制备得到具有特定3d结构的制品(如3d打印水凝胶制品，进一步如3d打印水凝胶支架)，还提供光交联性墨水及3d打印制品的制备方法。前述的光交联性墨水及3d打印制品可用于制备组织工程支架。

2、在本发明的第一方面，提供一种光交联性墨水，所述光交联性墨水包括水，还包括1～3mg/ml的碳碳双键化胶原、10～50mg/ml的碳碳双键化海藻酸盐和0.1wt％～0.5wt％的光引发剂；

3、其中，

4、所述碳碳双键化胶原中的碳碳双键取代度为30％～90％；

5、所述碳碳双键化海藻酸盐中的碳碳双键取代度为5％～30％；

6、所述光引发剂能够引发碳碳双键的交联反应；

7、所述光交联性墨水的ph为6.8～7.4。

8、在一些实施方式中，所述光交联性墨水满足如下特征中的一个或多个：

9、所述碳碳双键化胶原为甲基丙烯酸化的i型胶原；

10、所述碳碳双键化胶原的重均分子量为250kda～350kda；

11、所述碳碳双键化海藻酸盐为甲基丙烯酸化海藻酸盐；

12、所述碳碳双键化海藻酸盐的重均分子量为50kda～90kda；

13、所述光引发剂包括蓝光引发剂和irgacure系列光引发剂中的至少一种。

14、在一些实施方式中，所述光交联性墨水还含有细胞；

15、可选地，所述细胞包括l929细胞、mc3t3细胞、兔关节软骨细胞、猪关节软骨细胞和人脐带干细胞中的一种或多种。

16、在本发明的第二方面，提供一种光交联性墨水的制备方法，其包括如下步骤：

17、于ph2.2～2.8及2～8℃条件下，将碳碳双键化胶原和第一光引发剂混合于水中，然后于2～8℃条件下采用碱将ph值调至6.8～7.4，制得可交联胶原水溶液；其中，所述第一光引发剂能够引发碳碳双键的交联反应，所述碳碳双键化胶原中的碳碳双键取代度为30％～90％；

18、将碳碳双键化海藻酸盐和第二光引发剂混合于水中，制得可交联海藻酸盐水溶液；其中，所述第二光引发剂能够引发碳碳双键的交联反应，所述碳碳双键化海藻酸盐中的碳碳双键取代度为5％～30％；和

19、将所述可交联胶原水溶液与所述可交联海藻酸盐水溶液混合，制得本发明第一方面所述所述光交联性墨水。

20、在一些实施方式中，所述的制备方法满足如下特征中的一个或多个：

21、所述将碳碳双键化胶原和第一光引发剂混合于水中的步骤包括：将所述碳碳双键化胶原溶解于第一光引发剂水溶液中，其中，所述第一光引发剂水溶液含有0.1wt％～0.5wt％的所述第一光引发剂和酸；所述酸选自盐酸和醋酸中的一种或两种；

22、所述将碳碳双键化胶原和第一光引发剂混合于水中的条件包括：300～500rpm搅拌条件；

23、所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠和磷酸氢钠中的一种或多种；

24、所述将碳碳双键化海藻酸盐和第二光引发剂混合于水中的步骤包括：将所述碳碳双键化海藻酸盐溶解于第二光引发剂水溶液中，其中，所述第二光引发剂水溶液含有0.1wt％～0.5wt％的所述第二光引发剂；

25、所述将碳碳双键化海藻酸盐和第二光引发剂混合于水中的条件包括：300～500rpm搅拌条件；

26、所述第一光引发剂和所述第二光引发剂各自独立地包括蓝光引发剂和irgacure系列光引发剂的至少一种；

27、将所述可交联胶原水溶液与所述可交联海藻酸盐水溶液混合的体积比为1:(0.5～2)；

28、所述光交联性墨水在0.1wt％～0.5wt％的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂存在情况下，于405nm光照下30s内成胶；

29、所述光交联性墨水在0.1wt％～0.5wt％的i2959存在情况下，于365nm光照下300s内成胶。

30、在一些实施方式中，

31、所述碳碳双键化胶原采用包括如下步骤的方法制备得到：

32、将i型胶原蛋白于ph2.2～2.8水溶液中溶解，然后调节ph值至6.8～7.4，制备得到胶原蛋白溶液；

33、于2～8℃条件下，按照i型胶原蛋白：甲基丙烯酸酐为1g：(0.1～1ml)用量比，将所述胶原蛋白溶液与甲基丙烯酸酐混合，于2～8℃及ph 8±0.5条件下搅拌反应18～24h；

34、反应结束后，2～8℃条件下，采用14kda透析袋在水中透析70～75h，将透析产物冷冻干燥，制得所述碳碳双键化胶原；

35、所述碳碳双键化海藻酸盐采用包括如下步骤的方法制备得到：

36、将海藻酸盐溶于水中，然后调节ph值至6.8～7.4，制备得到海藻酸盐溶液；

37、于2～8℃条件下，按照海藻酸盐：甲基丙烯酸酐为1g：(5～20ml)用量比，将所述海藻酸盐溶液与甲基丙烯酸酐混合，于2～8℃及ph 8±0.5条件下搅拌反应18～24h；

38、反应结束后，采用14kda透析袋在水中透析70～75h，将透析产物冷冻干燥，制得所述碳碳双键化海藻酸盐。

39、在一些实施方式中，将所述可交联胶原水溶液与所述可交联海藻酸盐水溶液混合的步骤包括将所述可交联胶原水溶液、所述可交联海藻酸盐水溶液和细胞混合；

40、可选地，所述细胞包括l929细胞、mc3t3细胞、兔关节软骨细胞、猪关节软骨细胞和人脐带干细胞中的一种或多种。

41、在本发明的第三方面，提供一种3d打印制品，采用本发明第一方面所述的光交联性墨水或本发明第二方面所述的制备方法制备得到的光交联性墨水经3d打印制备而成。

42、在本发明的第四方面，一种3d打印制品的制备方法，其包括如下步骤：将本发明第一方面所述光交联性墨水或本发明第二方面所述的制备方法制备得到的光交联性墨水进行3d打印，所述光交联墨水在预定位置于光照条件下固化。

43、在一些实施方式中，3d打印条件包括如下一项或多项：针筒温度为18～25℃，打印平台温度为4～25℃，针头直径为0.16～0.55mm，打印速度为5～50mm/s，打印气压为0.05～0.3mpa；

44、所述光照条件包括：波长为365～405nm的紫外光照射，强度为10～300mw/cm2。

45、在本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的光交联性墨水，本发明第二方面所述的制备方法制备得到的光交联性墨水，本发明第三方面所述3d打印制品，或者本发明第四方面的制备方法制备得到的3d打印制品在制备组织工程支架中的应用。

46、在一些实施方式中，所述光交联性墨水满足如下特征中的一项或两项：

47、所述光交联性墨水在0.1wt％～0.5wt％的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂存在情况下，于405nm光照下30s内成胶；

48、所述光交联性墨水在0.1wt％～0.5wt％的i2959存在情况下，于365nm光照下300s内成胶。

49、本发明提供的光交联性墨水以碳碳双键化胶原(如甲基丙烯酸化胶原)和碳碳双键化海藻酸盐(如甲基丙烯酸化海藻酸盐)为主要基质材料，还包含光引发剂用以引发碳碳双键的交联反应，能够通过光交联反应快速形成稳定的共价键，进行3d打印时，交联反应所需时间短(例如，可以实现1min内形成稳定的3d制品，如3d支架)，而且自由基聚合具有“慢引发，快增长，速终止”特点，可以在极短的时间内使碳碳双键化胶原和碳碳双键化海藻酸盐发生交联聚合，可避免3d打印制品结构坍塌，制得的3d打印制品(如3d打印水凝胶)的三维网络稳定性好，不易发生结构皱缩或坍塌。本发明提供的光交联性墨水通过化学交联，在i型胶原蛋白分子链之间形成不容易降解的共价键，显著改善了i型胶原蛋白支架稳定性差的问题。此外，碳碳双键化胶原和碳碳双键化海藻酸盐均具有合适的碳碳双键取代度，碳碳双键化胶原的碳碳双键取代度相对较高，碳碳双键化海藻酸盐的碳碳双键取代度相对较低，二者协同搭配，使得该光交联性墨水打印性良好，可在设定的打印条件下顺利挤出，挤出后在打印平台上短时间不塌陷，交联聚合后形成的支架形状和尺寸与3d模型保持高度一致，3d打印得到的制品(如水凝胶)结构精准性高。

50、本发明提供的3d打印制品(如3d打印水凝胶制品，进一步如3d打印水凝胶支架)中，胶原成分和海藻酸盐成分之间通过共价键形成稳定的三维网络，结构稳定性好，不易发生结构皱缩或坍塌，而且传统的温敏胶原蛋白支架降解过快的问题显著抑制或不存在。此外，本发明提供的3d打印制品(如3d打印水凝胶制品，进一步如3d打印水凝胶支架)具有极高的细胞亲和性，有望在组织工程领域，包括但不限于组织工程支架领域，得到广泛应用。