一种三酶级联催化合成腺苷和/或尿苷的方法与流程

本发明属于生物，涉及一种三酶级联催化合成腺苷和/或尿苷的方法。

背景技术：

1、腺苷是一种天然存在的遍布人体细胞的内源性嘌呤核苷，是三磷酸腺苷(atp)的降解产物。腺苷以其扩血管作用而被人们所熟知，除具有广泛的心脏效应以及快速显著的冠脉扩张作用外，还具有触发或介导缺血预适应、减轻再灌注损伤等心脏保护效应。尿苷是rna和dna合成所必需的嘧啶核苷，具有多种生物学功能，可通过转化为尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸n-k-乙酰氨基葡萄糖等中间生物活性分子在糖、脂肪、蛋白质等物质代谢过程中发挥作用。

2、腺苷和尿苷的合成可分为化学合成法、生物发酵法以及酶工程合成法，如专利cn105884846a所公开的一种2’-脱氧腺苷的合成方法，将腺苷经酯化，酰化剂和缚酸剂的酰化作用，得到酰化物，再对所得酰化物再经过还原和纯化处理得到2’-脱氧腺苷，最终hplc纯度可达99％以上，但是，化学合成法制备2’-脱氧腺苷存在步骤长，反应条件较为苛刻，导致最终收率偏低，且反应过程中也需要用到各种有机试剂，对环境污染较为明显；如cn101575630a公开了一种生物转化法生产脱氧腺苷的方法，其通过培养瑞士乳杆菌作为酶源催化2’-脱氧腺苷的合成；cn104178541a中也公开了一种利用大肠埃希氏菌转化生产2’-脱氧腺苷的方法，通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2’-脱氧腺苷，但采用微生物发酵工艺较为复杂、成本较高、周期长，生产效率低。

3、综上所述，开发高效酶催化合成腺苷和/或尿苷的方法，对于腺苷和尿苷的应用领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种三酶级联催化合成腺苷和/或尿苷的方法，本发明设计三酶级联催化合成腺苷和/或尿苷的工艺，并挖掘特定的酶组合，实现高效合成腺苷和/或尿苷。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种三酶级联催化合成腺苷和/或尿苷的方法，所述方法包括：

4、以核糖化合物和核酸碱基为底物，以核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和核苷磷酸化酶为催化剂，进行反应，合成腺苷和/或尿苷，所述核糖化合物包括d-核糖和/或其衍生物，所述核酸碱基包括嘌呤碱基和/或嘧啶碱基，所述核苷磷酸化酶包括嘌呤核苷磷酸化酶和/或嘧啶核苷磷酸化酶。

5、本发明中，整合rk(核糖激酶，ribokinase)、ppm(磷酸戊糖变位酶，phosphopentomutase)、np(核苷磷酸化酶，nucleoside phosphorylase)构建三酶级联合成腺/尿苷的方法，并挖掘rk、ppm和np进行组合，实现高效合成腺苷和/或尿苷。

6、本发明中，挖掘rk、ppm和np进行组合，酶及其来源如下：核糖激酶(ribokinase，rk)，分别来自acanthamoeba castellanii(acrk)和escherichia coli(ecrk)；磷酸戊糖变位酶(phosphopentomutase，ppm)，分别来自escherichia coli(ecppm)，bacillus cereus(bcppm)，streptococcus mutans(smppm)和thermotoga maritima(tmppm)；嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，pnp)，分别来自deinococcus geothermalis(dgpnp)，parageobacillus thermoglucosidasius(ptpnp)和geobacillusstearothermophilus(gspnp)；嘧啶核苷磷酸化酶(pyrimidine nucleosidephosphorylase，pynp)，分别来自parageobacillus thermoglucosidasius(ptpynp)，geobacillus stearothermophilus(gspynp)和brevibacillus borstelensis(bbpynp)。

7、优选地，rk、ppm和np的组合包括：acrk、tmppm和gspnp的组合、ecrk、tmppm和gspnp的组合、ecrk、ecppm和gspnp的组合、ecrk、bcppm和gspnp的组合、ecrk、smppm和gspnp的组合、ecrk、tmppm和ptpnp的组合、ecrk、tmppm和dgpnp的组合、ecrk、tmppm和ptpynp的组合、ecrk、tmppm和gspynp的组合、ecrk、tmppm和bbpynp的组合、ecrk、tmppm和ptpynp的组合或ecrk、tmppm和gspynp的组合。

8、优选地，所述核糖激酶的氨基酸序列包括seq id no.1(acrk)或seq id no.2(ecrk)所示的序列。

9、优选地，所述磷酸戊糖变位酶的氨基酸序列包括seq id no.3(ecppm)、seq idno.4(bcppm)、seq id no.5(smppm)或seq id no.6(tmppm)所示的序列。

10、优选地，所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列包括seq id no.7(dgpnp)、seq idno.8(ptpnp)或seq id no.9(gspnp)所示的序列。

11、优选地，所述嘧啶核苷磷酸化酶的氨基酸序列包括seq id no.10(ptpynp)、seqid no.11(gspynp)或seq id no.12(bbpynp)所示的序列。

12、可以理解，本发明中挖掘到特定的rk、ppm和np，对所述酶进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期能够实现本发明的效果。

13、seq id no.1:acrk

14、meenqqqcpvrhiwepqqgqvqqqastgsecpvrntwdtsslyhtngqfqhppisqtngqarcpmgyfsisassgapasssdgapkcpfaslslgsstdrrappeqlrltilghvtndinifvgketraqgggvlfsgvaasnlgmnvevvtkcsaedkpvfqkifapsgtkvqflpsqettccennypkpnsdervqrfhavgapftvddlkhiestivhinplsygefpdelipkikelnpsvqylvadaqgfirhidmqnggkishkdwaakeqylkyfdlfkvddkeatvltgekdmkramqilhekgakmvlgtynagvllfdgnifyqasfgpwkvegrtgrgdtvtasflaaaglsggpwkrnvalefaarvtttkmqypgpyrrptasl。

15、seq id no.2:ecrk

16、mqnagslvvlgsinadhilnlqsfptpgetvtgnhyqvafggkganqavaagrsganiafiactgddsigesvrqqlatdniditpvsvikgestgvalifvngegenvigihaganaalspalveaqrerianasallmqlesplesvmaaakiahqnktivalnpaparelpdellalvdiitpneteaekltgirvendedaakaaqvlhekgirtvlitlgsrgvwasvngegqrvpgfrvqavdtiaagdtfngalitalleekplpeairfahaaaaiavtrkgaqpsvpwreeidafldrqr。

17、seq id no.3:ecppm

18、mkrafimvldsfgigatedaerfgdvgadtlghiaeacakgeadngrkgplnlpnltrlglakahegstgfipagmdgnaevigayawahemssgkdsvsghweiagvpvlfewgyfsdhensfpqelldklveranlpgylgncrssgtvildqlgeehmktgkpifytsaasvfqiacheetfgldklyelceiareeltnggynigrviarpfigdkagnfqrtgnrrdlaveppaptvlqklvdekhgqvvsvgkiadiyancgitkkvkatgldalfdatikemkeagdntivftnfvdfdsswghrrdvagyaaglelfdrrlpelmsllrdddililtadhgcdptwtgtdhtrehipvlvygpkvkpgslghretfadigqtlakyfgtsdmeygkamf。

19、seq id no.4:bcppm

20、mnkykriflvvmdsvgigeapdaeqfgdlgsdtighiaehmnglqmpnmvklglgniremkgiskvekplgyytkmqekstgkdtmtghweimglyidtpfqvfpegfpkelldeleektgrkiignkpasgteildelgqeqmetgslivytsadsvlqiaaheevvpldelykickiareltldekymvgrviarpfvgepgnftrtpnrhdyalkpfgrtvmnelkdsdydviaigkisdiydgegvteslrtksnmdgmdklvdtlnmdftglsflnlvdfdalfghrrdpqgygealqeydarlpevfaklkeddlllitadhgndpihpgtdhtreyvpllayspsmkeggqelplrqtfadigatvaenfgvkmpeygtsflnelkk。

21、seq id no.5:smppm

22、mslstfnrihlvvldsvgigaapdannfsnagvpdgasdtlghisktvglnvpnmakiglgniprdtplktvpaenhptgyvtkleevslgkdtmtghweimglnitepfdtfwngfpeeiiskiekfsgrkvireankpysgtaviddfgprqmetgeliiytsadpvlqiaahedvipldelyriceyarsitlerpallgriiarpyvgkprnftrtanrhdyalspfaptvlnkladagvstyavgkindifngsgitndmghnksnshgvdtliktmglsaftkgfsftnlvdfdalyghrrnahgyrdclhefderlpeiiaamkvddlllitadhgndptyagtdhtreyvpllayspsftgngvlpvghyadisatiadnfgvdtamigesfldkli。

23、seq id no.6:tmppm

24、mrvvlivldsvgigempdahlygdegsntivntakavsglhlpnmaklglgnlddipgvepvkpaegiygkmmekspgkdtttghweiagvilkkpfdlfpegfpkelieeferrtgrkvignkpasgteiikelgpihektgalivytsadsvfqiaakkeivpleelyryceiarellnemgykvarviarpftgewpnyvrtperkdfslepegktlldvltengipvygvgkiadifagrgvtenyktkdnndgidktislmkeknhdcliftnlvdfdtkyghrndpvsyakaleefdarlpeimhnlneddvlfitadhgcdpttpstdhsremvpllgyggrlkkdvyvgiretfadlgqtiadifgvpplengtsfknliwe。

25、seq id no.7:dgpnp

26、mvarvparpfasppatldrvsvhlnarpgeiaetvllpgdplraqhiaetffenpvqhnsvrgmlgftgtyrgvpvsvqgtgmgiassmiyvnelirdygcqtlirvgtagsyqpdvhvrdlvlaqaactdsninnirfglrnfapiadfelllrayqmardrgfathvgnilssdtfyqddpesyklwaqygvlavemeaaglytlaakygvraltiltisdhlvtreettaeerqttfngmievaldaalglavpsnsm。

27、seq id no.8:ptpnp

28、msihieakqqeiaekillpgdplraqyiaetflegatcynrvrgmlgftgtykghrisvqgtgmgvpsisiyvneliqsyhvqtlirvgtcgaiqkdvnvrdvilamsastdsnmnrltfrgrdyaptanfallrtayevgaekglplkvgsvftadmfyndepdwetwarygvlavemetaalytlaakfgrkalsvltvsdhiltgeettaqerqttfndmievaletairve。

29、seq id no.9:gspnp

30、msvhigakeheiadkillpgdplrakyiaetflegatcynqvrgmlgftgtykghrisvqgtgmgvpsisiyitelmqsynvqtlirvgtcgaiqkdvkvrdvilamtsstdsqmnrmtfggidyaptanfdllktayeigkekglqlkvgsvftadmfynenaqfeklarygvlavemettalytlaakfgrkalsvltvsdhiltgeettaeerqttfnemievaletairq。

31、seq id no.10:ptpynp

32、mvdliakkrdgyelskeeidfiirgytngdipdyqmsafamavffrgmteeetaaltmamvrsgdvidlskiegmkvdkhstggvgdtttlvlgplvasvgvpvakmsgrglghtggtidklesvpgfhveidneqfielvnknkiaiigqtgnltpadkklyalrdvtatvdsipliassimskkiaagadaivldvktgagafmkdfagakrlatamveigkrvgrktmavisdmsqplgyavgnalevkeaidtlkgkgpedlqelcltlgsymvylaekassleearalleasiregkaletfkvflsaqggdasvvddptklpqakyrweleapedgyvaeivadevgtaamllgagratkeatidlsvglvlhkkvgdavkkgeslvtiysntenieevkqklaksirlssipvakptliyetis。

33、seq id no.11:gspynp

34、mrmvdliekkrdghaltkeeiqfiiegytkgdipdyqmsalamaiffrgmneeetaeltmamvhsgdtidlsriegikvdkhstggvgdtttlvlgplvasvgvpvakmsgrglghtggtidklesvpgfhveitndefidlvnknkiavvgqsgnltpadkklyalrdvtatvnsipliassimskkiaagadaivldvktgvgafmkdlndakalakamvdignrvgrktmaiisdmsqplgyaignalevkeaidtlkgegpedfqelclvlgshmvylaekassleearhmlekamkdgsalqtfktflaaqggdasvvddpsklpqakyiieleakedgyvseivadavgtaamwlgagratkestidlavglvlrkkvgdavkkgeslvtiysnreqvddvkqklyenirisatpvqaptliydkis。

35、seq id no.12:bbpynp

36、mrmvdiiakkrdglelsseeiqflvsgytdgsipdyqmsawamavllrgmtpretgdltlamagsgeqldlsslkgikvdkhstggvgdkttlvvaplvaaagipvakmsgrglghsggtidklesfagfqvertreqflqqvreigvsvigqsgnltpadkklyalrdvtatveavpliassimskkiaagadailldvkvgkgafmktleqaetlasamaqigtqvgrrtvavisdmnqplgfavgnalevkeaidtlagrgpkdltelalaigahmlvlgelvadveegrkrleeimdsgkaveklaqmieaqggnkedvynpdrlpkasltaevkasqdgyisaidaetvghasvvlgagrltkempidlavgivlakkrgdqvrkgdvlatvhandeillkqaveelkgaytydseslidqpliykiite。

37、优选地，所述衍生物包括戊醛糖如d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、l-来苏糖和d-核糖；脱氧糖如2'-脱氧-d-核糖、2'，3'-二脱氧-d-核糖、d-岩藻糖、l-岩藻糖、d-鼠李糖、l-鼠李糖等。

38、优选地，所述嘌呤碱基包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、6-羟基嘌呤、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、6-三氟甲基氨基嘌呤、6-苯甲酰基氨基嘌呤、6-乙酰基氨基嘌呤、6-羟氨基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-苯甲酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲巯基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-氨基-6-甲巯基嘌呤、2-氨基-6-羟氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-环丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、2-氯腺嘌呤、2-氟腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基丙基腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、9-甲基次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-硫鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮鸟嘌呤、8-硝基腺嘌呤、8-硝基鸟嘌呤、8-氟腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-氟鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤或8-羟基鸟嘌呤等。

39、优选地，所述嘧啶碱基包括胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟甲基胞嘧啶、5-氟甲基尿嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-乙烯基尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氯乙烯基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-硫胸腺嘧啶、5、6-二氢胞嘧啶、5-硝基胞嘧啶、n4-乙基胞嘧啶或n4-乙酰胞嘧啶等。

40、优选地，所述核糖化合物和核酸碱基的摩尔比为1:(1.1～1.3)。

41、优选地，所述核糖化合物、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和核酸磷酸化酶的加料比为1:0.1:0.1:0.1。

42、优选地，所述反应的温度为30～40℃，包括但不限于31℃、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃，时间为0.5～2h，包括但不限于0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.2h、1.5h、1.6h、1.8h或1.9h。

43、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

44、本发明整合rk(核糖激酶，ribokinase)、ppm(磷酸戊糖变位酶，phosphopentomutase)、np(核苷磷酸化酶，nucleoside phosphorylase)构建三酶级联合成腺/尿苷的方法，并挖掘rk、ppm和np进行组合，实现高效合成腺苷和/或尿苷。