耐热性RNA聚合酶

本发明涉及新的耐热性rna聚合酶，及其用于体外转录和在诊断方法中的用途。

背景技术：

1、体外转录(ivt)反应通常需要包括启动子的模板核酸分子、三磷酸核糖核苷酸、含有dtt和镁离子的缓冲体系以及合适的核糖核酸(rna)聚合酶。所述rna聚合酶通常选自单亚基噬菌体来源的rna聚合酶，诸如sp6、t3和t7。转录起始于rna聚合酶与其启动子序列的结合，然后模板链进入活性位点，产生rna转录物，并终止转录反应。

2、除了用于ivt外，rna聚合酶常用于核酸扩增方法，特别是用于诊断目的。例如，基于核酸序列的扩增(nasba；us5654142a)和转录介导的扩增(tma；wo1991001384a1)涉及交替循环(alternating cycli)，其中rna聚合酶和逆转录酶在等温条件下连续地产生彼此的模板。扩增后，通过例如在定量pcr(也称为定量实时pcr)中采用的可检测的标记可检测互补寡核苷酸探针的杂交。此外，某些基于成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)-crispr相关(cas)蛋白质的核酸检测系统利用了rna中间体(steens et al.，2021，nature comm 12：1-12)。

3、如果能提高反应温度以提高反应速率将是有利的。例如，如果提高等温扩增的反应温度，就可能扩增出具有二级结构的rna。然而，尽管鉴定了比野生型噬菌体来源的rna聚合酶表现出更高的热稳定性的rna聚合酶变体(boulain et al.，2013，protein eng dessel，26(11)：725-734)，但目前没有市售的rna聚合酶在65℃下孵育超过5分钟后仍保持活性。

4、因此，需要在较高的反应温度下具有改善的稳定性和活性的rna聚合酶。

技术实现思路

1、本发明提供了一种方法，包括：在核糖核酸核苷酸(rntr)和合适的缓冲液的存在下，将模板核酸分子和与seq id no:1具有至少50％序列一致性的蛋白质一起孵育；以及通过在30℃和80℃之间的温度下进行转录反应，将至少部分所述模板核酸分子转录成rna分子。所述模板核酸分子优选为脱氧核糖核酸(dna)模板分子，为单链或双链dna模板分子。所述缓冲液优选包括25mm至200mm的nacl。所述转录反应优选在45℃至75℃的温度下进行。模板核酸分子可以通过包括预扩增反应在内的任何方式产生。

2、经转录的rna分子可进一步与基于成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)-crispr相关(cas)蛋白的核酸检测系统一起孵育。所述crispr-cas核酸检测系统优选地包括：a)包括iii型cas蛋白质和至少一种与靶rna分子结合的crispr rna(crrna)的效应复合物；b)用于直接或间接确定环状寡聚腺苷酸(coa)水平的装置。在本发明的优选方法中，预扩增反应、转录反应，以及与核酸检测系统的孵育均在一锅反应中进行。

3、本发明进一步提供与seq id no:1具有至少50％序列一致性的蛋白质。所述蛋白质优选地包括合适的标签。

4、本发明进一步提供编码本发明的蛋白质的核酸分子。所述核酸分子优选进行密码子优化，以在合适的宿主细胞中表达所述蛋白质。

5、本发明进一步提供了表达本发明的蛋白质的宿主细胞。

6、本发明进一步提供了本发明的蛋白质在进行转录反应以将至少部分模板核酸分子转录成rna分子中的用途。所述转录反应优选在30℃和80℃之间的温度下进行，优选在45℃和75℃之间的温度下进行。

1.一种方法，包括：

2.根据权利要求所述1的方法，其中，所述模板核酸分子为脱氧核糖核酸(dna)模板分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述缓冲液包括25mm至200mm的nacl。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述转录反应在45℃和75℃之间的温度下进行。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述模板核酸分子通过预扩增反应产生。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，经转录的rna分子进一步与基于成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)-crispr相关(cas)蛋白的核酸检测系统一起孵育。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述crispr-cas核酸检测系统包括：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述预扩增反应、转录反应以及与核酸检测系统的孵育均在一锅反应中进行。

9.一种与seq id no:1具有至少50％序列一致性的蛋白质。

10.根据权利要求9所述的蛋白质，所述蛋白质包括合适的标签。

11.一种编码权利要求9或10所述的蛋白质的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的核酸分子，所述核酸分子进行密码子优化，以在合适的宿主细胞中表达所述蛋白质。

13.一种表达权利要求9或10所述的蛋白质的宿主细胞。

14.根据权利要求9或10所述的蛋白质在进行转录反应以将至少部分模板核酸分子转录成rna分子中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述转录反应在30℃和80℃之间的温度下进行，优选在45℃和75℃之间的温度下进行。