高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母工程菌及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及合成肌醇的马克斯克鲁维酵母工程菌及其应用。

背景技术：

1、肌醇最早于1850年从肌肉提取物中分离出来(bizzarri et al.,eur rev medpharmacol sci.2014,18:1896-1903)，在生物体中具有多种功能(michell et al.,biochem soc symp.2007,74:223-46)，在过去二十年中引起临床医生的关注(dinicola etal.,int j mol sci,2021,22:10575)，各种研究表明肌醇或其衍生物能够影响胚胎发育、胰岛素信号传导、应激反应等(thomas et al.,angew chem int ed,2016,55:1614)。人体自身具有内源性的肌醇合成途径，内源性的肌醇能够通过葡萄糖-6-磷酸合成，葡萄糖-6-磷酸被肌醇-3-磷酸合酶(inositol1-phosphate synthase，ips)异构成肌醇-3-磷酸(wonget al.,neurochem,1987,48:1434-1442)，再由肌醇单磷酸酶(inositolmonophosphatase，imp)去磷酸化形成肌醇(loewus et al.,j biol chem.1980,255:11710-11712.)。但仍然每天需要通过饮食从谷物，豆类，坚果中摄取大约1g的肌醇(dinicola et al.,s int j mol sci,2017,18:2187.)，尤其是人体内源性肌醇不足以满足人体的生理需求时。基于人体的需求及多种功能，肌醇被广泛应用于食品、饲料、医药、化妆品、工业等领域。

2、肌醇生产可分为化学酸水解法、体外酶合成、生物发酵法。化学酸水解主要以植酸盐为原料，通过加压酸水解的处理方式提取肌醇(li et al.,biotechnol applbiochem.2022,69:1101-1111)，但过程中会产生大量化学废液，并且步骤过程相对繁琐。体外酶合成的方法，则能够组合不同来源的纯化的酶，辅酶，实现一锅法的生物级联反应(youet al.,process biochem.2017,52:106-14)，并且过程可控，产率高，产物易分离，相比化学酸水解法具有显著优势，但相比生物发酵法，酶的生产成本高，同时酶也有不稳定性。生物发酵法，则是通过不同微生物宿主生产肌醇，具有绿色可持续的优势。近年来，具有代表性的生物发酵法生产肌醇的宿主主要有大肠杆菌(you et al.,microb cell fact.2020,19:109)和毕赤酵母(zhang et al.,microb cell fact.2022,21:112)，大肠杆菌中能够实现高滴度，但其并非食品安全菌株限制了应用前景。而在毕赤酵母中肌醇滴度则显著低于在大肠杆菌中，因此生物发酵产肌醇的微生物宿主仍有进一步挖掘，提升的空间。

3、马克斯克鲁维酵母是一种非常规酵母，是目前已知生长最快的酵母(groeneveldet al.,febs j,2009,27:254-270)，具有耐温性高(lane et al.,anton leeuw int j g,2011,100:507-519)，能够利用菊粉、木糖、乳糖等多种碳源(fonseca et al.,applmicrobiol bioechnol,2008,79(3):339-354)，也是是gras生物，获得qps认证，被我国卫生部认定为是食品安全菌株(wu et al.,j biotechnol,2020,320:11-16)。并在2012年完成全基因组测序(jeong et al.,eukaryotic cell,2012,11:1584-1585)。马克斯克鲁维酵母生理和代谢特性使其在生物技术上有着广泛的应用。作为一种广泛的crabtree阴性酵母，它喜欢呼吸而不是发酵，因此不需要将乙醇代谢转移出去。野生型酵母已经被用于生产芳香化合物，它可以以高于2g l-1h-1的速率合成乙酸乙酯。2017年开发针对马克斯克鲁维酵母的基因编辑工具(et al.,biotechnol biofuels,2017,10:164)使其具备了进行多元复杂遗传改造和代谢改造的基础，从而逐渐用于生产蛋白及各种具有经济价值的产品。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母代谢工程菌株及其应用。

2、本发明所提供的高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母代谢工程菌株，由如下步骤构建得到：

3、(1)利用crispr基因编辑技术，在马克斯克鲁维酵母fim1δura3菌株，敲除基因组的葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi基因(genbank登录号：qgn13438.1)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf1基因(genbank登录号：qgn16990.1)，构建获得马克斯克鲁维酵母菌株，记为fim1δura3δpgiδzwf1；

4、(2)在马克斯克鲁维酵母菌株fim1δura3δpgiδzwf1中敲除肌醇加氧酶miox5基因(genbank登录号：qgn14246.1)，构建得到马克斯克鲁维酵母底盘菌株，记为fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5；

5、(3)在马克斯克鲁维酵母底盘菌株fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5中敲除肌醇转运蛋白itr2基因(genbank登录号：qgn17849.1)，构建获得马克斯克鲁维酵母底盘菌株，记为fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5δitr2；

6、(4)用菊粉酶启动子pinu和tef终止子ttef，构建布氏锥虫trypanosoma brucei肌醇磷酸合酶tbips基因表达框；用tef启动子ptef和菊粉酶终止子tinu构建大肠杆菌escherichia coli基因肌醇单磷酸酶ecimp基因表达框；将tbips基因表达框和ecimp基因表达框依次插入到一个马克斯克鲁维酵母表达载体pukdn115上，构建获得肌醇磷酸合酶tbips和肌醇单磷酸酶ecimp共表达质粒，记为pukdn115-pinu-ecimp-ttef-ptef-tbips-tinu；

7、(5)将构建获得的表达质粒pukdn115-pinu-ecimp-ttef-ptef-tbips-tinu转化至步骤(2)中所述的马克斯克鲁维酵母菌株fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5或步骤(3)中所述的马克斯克鲁维酵母菌株fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5δitr2；筛选分别获得：

8、马克斯克鲁维酵母工程菌株fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5/pukdn115-pinu-ecimp-ttef-ptef-tbips-tinu，命名为马克斯克鲁维酵母jc-3；

9、马克斯克鲁维酵母工程菌菌株fim1δura3δpgiδzwf1δmiox5δitr2/pukdn115-pinu-ecimp-ttef-ptef-tbips-tinu，命名为马克斯克鲁维酵母jc-4。

10、上述马克斯克鲁维酵母fim1δura3菌株，是将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心马克斯克鲁维酵母fim1菌株(保藏号：cgmcc no.10621)，敲除基因组上的尿嘧啶合成酶基因ura3所获得。

11、步骤(3)中所述的马克斯克鲁维酵母表达载体pukdn115，含有马克斯克鲁维酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、菊粉酶终止子和筛选标记基因ura3等元件。

12、在马克斯克鲁维酵母菌株fim1δura3中，敲除葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi基因，其目的是阻断葡萄糖-6-磷酸在细胞内异构为果糖-6-磷酸，从而进入emp途径(embden-meyerhof-parnas pathway)。

13、在马克斯克鲁维酵母菌株fim1δura3中，敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf1基因，其目的是阻断葡萄糖-6-磷酸在细胞内氧化成6-磷酸葡萄糖酸，从而进入磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)。

14、进一步地，在马克斯克鲁维酵母fim1δura3δpgiδzwf1菌株中，敲除肌醇加氧酶miox5基因，其目的是防止生成的肌醇被氧化降解。

15、在马克斯克鲁维酵母fim1δura3δpgiδzwf1菌株中，敲除肌醇转运蛋白itr2基因，其目的是阻断肌醇转运至胞内被代谢利用。

16、为在马克斯克鲁维酵母细胞内合成肌醇，本发明提供了一种共表达肌醇磷酸合酶tbips和肌醇单磷酸酶ecimp的方法，包括，tbips基因表达框和ecimp基因表达框串联构建在pukdn115载体上，然后导入马克斯克鲁维酵母。

17、所述肌醇磷酸合酶tbips，其核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seqid no.2所示。

18、所述肌醇单磷酸酶ecimp，其核苷酸序列如seq id no.3所述，氨基酸序列如seqid no.4所示。

19、本发明还提供利用上述马克斯克鲁维酵母代谢工程菌株(包括马克斯克鲁维酵母jc-3、jc-4)高效合成肌醇的方法，具体是将马克斯克鲁维酵母代谢工程菌株作为发酵菌株，以葡萄糖、甘油、酵母提取物、蛋白胨等成分为培养基，经培养发酵产生肌醇。

20、具体操作如下：将马克斯克鲁维酵母jc-3或jc-4接种至50ml含有2％甘油的ypd培养基中，在30℃下，220rpm条件下连续培养168h。其中，在培养至96h时补加1ml 50％的甘油，葡萄糖每24h补加1ml50％的葡萄糖。发酵144h-168h，得到高产量肌醇：29.1g/l-38.9g/l。

21、具体地，发酵144h，肌醇的产量可达29.1g/l，发酵至168h时，肌醇产量为38.9g/l。

22、一种优选方式是，将含有2％甘油的ypd培养基的马克斯克鲁维酵母jc-3或jc-4，以起10％种量接种至2％甘油的ypd培养基的发酵罐中，流加50％葡萄糖为第一碳源，流加50％的甘油为第二碳源，进行连续补料发酵，在连续补料发酵条件下，菌株高密度发酵168-192小时，得到高产量肌醇：59.68g/l-80.65g/l。

23、具体地，菌株高密度发酵168h，肌醇产量可达59.68g/l，糖醇转化率达到56.65％；高密度发酵192h，肌醇产量为80.65g/l。

24、本发明提供的马克斯克鲁维酵母工程菌株能够高效利用葡萄糖合成肌醇，有着广泛的应用前景，能够实现肌醇的大规模发酵生产，并且在产量上具有显著优势，有良好的应用价值。