一种干细胞外泌体高活性冻干配方及其冻干工艺的制作方法

本发明属于生物，特别是一种干细胞外泌体高活性冻干配方。

背景技术：

1、随着生物科技的飞速发展，干细胞研究获得了不断的发展，而针对干细胞的发展之下，干细胞外泌体冻干凭借其独特的生物学特性和广泛的应用前景，得到进一步的发展。

2、干细胞外泌体是细胞在特定条件下分泌的一种微小囊泡，直径约为30-150纳米。它们富含多种生物活性物质，如蛋白质、脂质、核酸等，这些物质在细胞间信息传递和物质交换中发挥着重要作用。

3、为了方便干细胞外泌体的保存与运输，现有技术通过将提取得到的干细胞外泌体，经过冷冻干燥技术制成的粉末状产品，这种冻干粉保留了外泌体的完整结构和生物活性。

4、干细胞外泌体冻干后，能够应用于医疗领域，干细胞外泌体冻干后可用于不同疾病模型的组织修复、治疗等。

5、然而，现有技术制备的干细胞外泌体冻干配方的外泌体复苏率相对较低，导致外泌体的活性大幅度下降，引发其对于组织修复、治疗效果明显下降。

6、基于此，提供一种干细胞外泌体高活性冻干配方，来解决现有的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种干细胞外泌体高活性冻干配方及其冻干工艺，以解决现有技术中的不足。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种干细胞外泌体高活性冻干配方，按重量份计包括以下成分制成：干细胞外泌体90-100份、海藻酸钠1-5份、丝胶蛋白混合物3-6份、甘露醇5-15份、苦荞提取物0.3-0.6份、β-巯基乙醇0.3-0.6份。

4、作为进一步的技术方案，所述丝胶蛋白混合物：苦荞提取物：β-巯基乙醇重量份比为10:1:1。

5、作为进一步的技术方案，所述苦荞提取物制备方法为：

6、将经过干燥后的苦荞添加到粉碎机中，进行粉碎处理，过80目筛，得到苦荞粉；

7、然后，采用石油醚对苦荞粉进行脱脂处理，得到脱脂苦荞粉；

8、采用质量分数为80％的乙醇溶液对脱脂苦荞粉进行混合，然后经过回流处理2小时，过滤，去除滤液，得到滤渣，经过干燥至恒重，得到初步处理物；

9、将纯净水经过等离子体处理10min，得到预处理纯净水；

10、将所得到的预处理纯净水与初步处理物进行混合，经过超声分散10min，再经过加热回流提取4-5小时，最后进行一次离心处理，取上清液；

11、将上清液浓缩至原体积的40％；

12、向经过浓缩后的上清液中添加3倍体积的无水乙醇，置于4℃醇沉24小时，然后再经过二次离心处理，收集沉淀，经过干燥，得到。

13、作为进一步的技术方案，石油醚对苦荞粉进行脱脂处理为：

14、将苦荞粉与石油醚进行混合，以500r/min转速进行搅拌处理2小时，静置1小时，然后经过旋蒸干燥，即可；

15、其中，苦荞粉与石油醚混合比例为12-18g：150ml；

16、质量分数为80％的乙醇溶液、脱脂苦荞粉按1:5质量比例混合。

17、作为进一步的技术方案：所述预处理纯净水制备方法为：

18、将纯净水经过等离子体处理；

19、其中，等离子体处理时间为30min，功率为180w；

20、等离子体处理气体为氦气。

21、作为进一步的技术方案，所述预处理纯净水与初步处理物混合比例为1:12-15；

22、所述一次离心处理的转速为7500r/min；

23、所述二次离心处理的转速为6000r/min。

24、作为进一步的技术方案，所述丝胶蛋白混合物制备方法为：

25、首先，采用蒸馏水将蚕茧进行清洗10min，然后进行干燥至恒重，其中，干燥温度为60℃，时间为10小时；

26、将经过清洗干燥后的蚕茧进行剪碎，得到蚕茧碎料；

27、将蚕茧碎料添加到蒸馏水中，搅拌混合，得到混合液；

28、调节混合液ph至6.5；

29、向混合液中添加木瓜蛋白酶，进行搅拌混合2-3小时，然后经过灭活处理，再经过离心处理，取上清液，经过冻干，得到丝胶蛋白混合物。

30、作为进一步的技术方案：所述蚕茧碎料、蒸馏水混合质量比为1:40-50；

31、所述混合液与木瓜蛋白酶混合比例为1kg：3g；

32、所述木瓜蛋白酶添加后，在55℃下进行搅拌混合；

33、其中，灭活为在95℃下处理5min；

34、离心转速为4500r/min。

35、一种干细胞外泌体高活性冻干配方的冻干工艺，包括以下步骤：

36、s1首先，将苦荞提取物、丝胶蛋白混合物依次添加到无菌水中，搅拌混合均匀，得到第一混合液；

37、s2将干细胞外泌体添加到第一混合液中，然后混合均匀，置于37℃下培养2小时，得到培养液；

38、s3向培养液中依次添加海藻酸钠、甘露醇、β-巯基乙醇进行混合均匀，在37℃下培养30min，得到第二混合液；

39、s4对第二混合液进行预冻处理24h；

40、s5经过预冻处理后再进行冷冻处理24小时，然后置于4℃下保存，即可。

41、作为进一步的技术方案：第一混合液中苦荞提取物浓度为1mo l/l；

42、预冷冻温度为-80℃；

43、冷冻干燥温度为-55℃，真空压力为12pa。

44、有益效果：

45、本发明制备的干细胞外泌体冻干配方具有较高的活性，能够在经过水化后，保持较高的复苏率，从而极大的提高了其生物稳定性。

46、本发明主要是通过在真空条件下，将水分直接从固态升华成气态，从而避免了冰晶形成对外泌体结构的破坏，这种低温低压的环境可以有效减少外泌体的氧化和降解反应，从而使得所获得的干细胞外泌体冻干配方保持其生物活性。

47、本发明工艺中通过进行预冻处理，主要是将溶液置于低温环境下，使得其中的水分结冰形成稳定的晶体结构，为后续冻干做铺垫，再在后续冻干过程中使冰晶升华，最终得到干燥的外泌体粉末。

48、本发明通过引入了丝胶蛋白混合物，有助于保持外泌体中蛋白质、核酸等生物大分子的结构和功能完整性，能够在冻干过程中减少氧化和降解作用。

49、通过引入的苦荞提取物，能够在冻干过程中保护细胞膜结构，对于肝细胞外泌体的细胞膜结构得以保护，而这对于保证外泌体的生物活性具有极其重要的影响，冻干粉中还会残留少量的水分以无定形状态存在，配合β-巯基乙醇的作用，能够在进一步的保护细胞膜免受机械损伤。通过引入的海藻酸钠、甘露醇配合作用，能够进一步的提高外泌体冻干粉的稳定性，在低温下长时间保存而不影响其生物活性，具有较高的复苏率。

50、本发明制备的外泌体高活性冻干配方产品能够在再生医学、疾病诊断与治疗以及医疗美容等领域得到显著的应用。

1.一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，按重量份计包括以下成分制成：干细胞外泌体90-100份、海藻酸钠1-5份、丝胶蛋白混合物3-6份、甘露醇5-15份、苦荞提取物0.3-0.6份、β-巯基乙醇0.3-0.6份。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，所述丝胶蛋白混合物：苦荞提取物：β-巯基乙醇重量份比为10:1:1。

3.根据权利要求2所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，所述苦荞提取物制备方法为：

4.根据权利要求3所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，石油醚对苦荞粉进行脱脂处理为：

5.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于：所述预处理纯净水制备方法为：

6.根据权利要求5所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，所述预处理纯净水与初步处理物混合比例为1:12-15；

7.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于，所述丝胶蛋白混合物制备方法为：

8.根据权利要求7所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方，其特征在于：所述蚕茧碎料、蒸馏水混合质量比为1:40-50；

9.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方的冻干工艺，其特征在于：包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的一种干细胞外泌体高活性冻干配方的冻干工艺，其特征在于：第一混合液中苦荞提取物浓度为1mol/l；