新冠后遗症动物模型、构建方法及其应用与流程

本技术涉及新冠后遗症动物模型，具体为一种新冠后遗症动物模型、构建方法及其应用。

背景技术：

1、感染新冠病毒后，新冠病毒在人体中大量复制、四处攻击，目前已有文献报道的，包括脑、眼、心、肺、肾等多个器官；在新冠中、新冠后，残留的新冠病毒各成分均会对机体造成长久持续性的损害。每次感染后，新冠病毒的残留组分都会在人体中残留至少8-12个月,伴随着各类持续性的身体伤害，即新冠后遗症症状,也称长新冠。据科学统计,至少有36种新冠后遗症症状，包括疲劳、睡眠障碍、心脏问题、新发持续咳嗽和脑雾。不幸的是,即使在新冠后遗症出现一年后,也只有29%的人群觉得完全恢复了。

2、新冠后遗症将是长期困扰大众的一个亟待解决的问题。

3、药物筛选是药物开发过程中的一个重要环节，对于新冠病毒带来的感染和损伤，可以从预防、阻断传播途径，或抑制病毒复制，或中和病毒等角度入手，还可从减轻、预防、治疗新冠病毒损伤的角度入手。目前新冠病毒相关的筛选系统，多着眼于如何阻断病毒感染入侵阶段或干扰感染后的复制阶段，其体系或应用活病毒、或应用假病毒，或人体试验。使用的病毒成分含量复杂、试验开展条件并不具备普适性，筛选过程中的危害性、可能造成的风险较大，周期漫长、成本较高。

4、申请号为2023111378056的发明专利明公开了一种新冠病毒s蛋白致斑马鱼仔鱼嗅神经损伤模型的构建方法及应用，属于动物模型构建技术领域。构建方法包括：取受精后3～10天的gaba能神经元和中性粒细胞具有不同荧光标记的转基因斑马鱼系仔鱼，麻醉后鼻内给予sars-cov-2病毒s1蛋白进行感染，然后复苏；造模3～24小时后，结合活体荧光成像技术挑选荧光强度与未感染比较存在显著性差异的仔鱼即为所述模型。该专利构建的一种新冠病毒在感染阶段的嗅觉损伤模型，针对的是病毒感染阶段模型。其主要目的在于筛选能预防新冠感染、病毒入侵阶段的药物，而且主要是嗅觉神经。

5、但是，该专利主要是在斑马鱼体外进行感染，只针对感染阶段，仅局限于嗅神经，并没有研究新冠病毒侵染完成后、甚至病人康复后，新冠成分残留在机体引起广泛的持续性损伤的模型。因此，该专利只针对斑马鱼嗅神经在新冠病毒体外感染阶段的研究。与本专利在专精于新冠病毒侵染完成后、甚至病人康复后，新冠成分残留在机体内引起广泛的持续性损伤的模型完全不同。

6、同时，新冠后遗症的特征在于机体长期残留有新冠残留物，主要存在各器官和血液中。因此急需建立一种评价和筛选药物治疗新冠后遗症效果的方法，既能很好的模拟新冠病毒成分在体内的损害，又能快速方便的评价和筛选治疗新冠后遗症的药物，造模简易、安全有效，这是具有重要的实际应用价值的。

技术实现思路

1、本技术提供一种新冠后遗症动物模型、构建方法及其应用，可以快速、准确评价和筛选对新冠后遗症具备治疗效果的药物。

2、本技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种新冠后遗症动物模型，包括：注射新冠病毒重组蛋白的斑马鱼，新冠病毒重组蛋白的注射浓度为≥1ng/尾，注射的新冠病毒重组蛋白的纯度＞50%，所述新冠后遗症动物模型用于评价和筛选对新冠后遗症具备治疗效果的药物。

3、本技术既可用于评价已知药物，如各类诱导剂、治疗药物、保健品、功能食品等的毒性或功效，还可用于筛选未知药物，新药开发、新结构、新配方、新治疗方法，能很好的模拟新冠病毒成分在体内的损害，又能快速方便的评价和筛选治疗新冠后遗症的药物，造模简易、安全有效，应用价值巨大，能可靠、快速、高效、准确的反映药物在体内的真实情况，性价比高，并且填补了国内外在新冠后遗症药物筛选和评价方法上的空白。

4、作为优选，注射的新冠病毒重组蛋白的纯度＞90%。

5、作为优选，注射的新冠病毒重组蛋白的纯度＞95%。

6、作为优选，斑马鱼为受精后5天的斑马鱼。

7、作为优选，新冠病毒重组蛋白的包括：新冠病毒重组s蛋白、新冠病毒重组n蛋白、新冠病毒重组m蛋的至少一种。

8、作为优选，向斑马鱼注射新冠病毒重组蛋白的注射位置为卵黄囊或血管，注射时间在斑马鱼5dfp之后，向卵黄囊和血管直接注射新冠组分，使其随血液流转，形成广泛的体内损伤，更加符合新冠后遗症的特点，针对的是康复和疗愈阶段，新冠残留物在体内广泛损伤的研究。

9、作为优选，新冠病毒重组蛋白经原核系统、酵母系统、昆虫系统或哺乳动物系统表达纯化。

10、作为优选，新冠病毒重组蛋白经哺乳动物蛋白表达系统表达纯化。

11、作为优选，所用新冠病毒重组蛋白经293表达系统或cho表达系统表达纯化。

12、一种新冠后遗症动物模型构建方法，用于如上述的新冠后遗症动物模型的构建，将斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射新冠病毒重组蛋白。

13、一种新冠后遗症药物评价和筛选方法，采用如上述的新冠后遗症动物模型作为动物模型，包括以下步骤：

14、步骤一、设置正常对照组：将斑马鱼置于水中培养；

15、步骤二、设置模型组：将步骤一同规格的斑马鱼置水中培养，并向斑马鱼注射新冠病毒重组蛋白以造模；

16、步骤三、设置待测样品组：将步骤一同规格的斑马鱼置水中培养，并向斑马鱼的卵黄囊或血管中注射新冠病毒重组蛋白和待测药物样品；

17、步骤四、检测评价：取正常对照组、模型组和待测样品组的斑马鱼进行检测，比较待测样品组中的各个待测药物和模型组的评价指标，评价待测药物治疗或调节新冠后遗症的功效。

18、作为优选，评价指标包括：免疫细胞改善作用、活性氧指标改善作用、细胞凋亡改善作用、病理改善作用的至少一个。

19、作为优选，免疫细胞改善作用包括中性粒细胞改善作用、巨噬细胞改善作用、t细胞改善作用，b细胞改善作用、免疫细胞特定功能因子以及免疫细胞特定表面标志物，免疫细胞特定功能因子如tnf-α、il-2。

20、作为优选，活性氧指标改善作用包括：活性氧改善作用、一氧化氮改善作用以及其他氧化损伤指标，活性氧改善作用通过检测斑马鱼体内过氧化氢的积累量或氧自由的荧光强度反应斑马鱼体内氧化应激的程度，检测时采集斑马鱼全鱼或斑马鱼卵黄囊的荧光照片进行分析。

21、作为优选，评价公式为：药物改善新冠后遗症的功效=（模型组-待测样本组)/(模型组-正常对照组）×100%。

22、作为优选，根据不同的实验目的和实验要求，可以选择其中一种评价指标进行评价，也可以选择多种指标综合评价，本技术的评价标准如下：当待测样品组相对于模型组的评价指标的显著性差异水平p＜0.05时，药物有明显改善新冠后遗症的效果；否则该药物不具备改善新冠后遗症的效果或效果不明显。

23、本技术的实质性效果是：

24、（1）本新冠后遗症动物模型采用斑马鱼活体作为模型动物和受试动物，能够在整体生物活性的背景下真实反映药物在体内的药理作用和药代动力学特征，其中斑马鱼幼鱼体型小，为1-4毫米，可以在微孔板，如96孔板、384孔板中进行分析，以满足高通量、自动化的快速筛选需求；

25、（2）本新冠后遗症动物模型采用斑马鱼实验的费用低，相比猴、犬、鼠作为动物载体，以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天的成本小于0.1元，斑马鱼实验发育周期短、单次产卵数量高、同一亲本子代的差异性小，适合批量实验，有利于消除个体差异，且稳定性和重复性好，实验操作简单；

26、（3）本新冠后遗症动物模型采用合适剂量的新冠病毒重组n蛋白进行造模，排除了组成新冠病毒的其他复杂成分的干扰，有利于认识新冠病毒单一组分造成的特征性损伤，更有利于找到针对性的药物；

27、（4）本新冠后遗症药物评价和筛选方法中，由于活性氧是全身广泛的，因此以机体表征作为评价指标，有利于在广泛的新冠损伤中对药精确性作用进行评价，采用活性氧的荧光探针作为测试指标，提供了比较稳定可靠的观测指标；

28、（5）本新冠后遗症动物模型既可用于评价已知药物，如各类诱导剂、治疗药物、保健品、功能食品等的毒性或功效，还可用于筛选未知药物，新药开发、新结构、新配方、新治疗方法等的毒性或功效，应用价值巨大；

29、（6）本新冠后遗症药物评价和筛选方法是一种全新的针对新冠后遗症的药物评价模型与评价方法，能可靠、快速、高效、准确的反映药物在体内的真实情况，性价比高，并且填补了国内外在新冠后遗症药物筛选和评价方法上的空白。