一种负载多种生长因子的骨胶原支架材料及其制备方法与流程

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种负载多种生长因子的骨胶原支架材料及其制备方法。

背景技术：

1、牙周炎(periodontitis)也被称为破坏性牙周病，是一种慢性炎症疾病，主要源于牙菌斑中的细菌对牙周组织的破坏。牙周炎可导致牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的破坏，牙周袋(牙齿和牙龈之间缝隙加宽形成的小口袋)形成、附着丧失和牙槽骨的吸收，随着病程进展牙齿会慢慢松动，牙龈退缩最终可导致牙齿丧失。口腔种植修复是目前恢复牙列缺损/缺失患者首选的修复方式，但待种植区牙槽骨常出现萎缩现象，会导致牙槽发生骨量不足，容易对修复效果产生重大影响。

2、据不完全统计，我国成年人中患有牙周炎的比例高达60％以上，目前引导骨组织再生技术为辅助治疗的主流术式，主要是通过在牙周骨丧失部位植入骨替代品或其他生物材料，促进新骨形成。目前临床使用的骨替代材料大致分为人工合成材料和生物骨材料，其中人工合成材料存在降解速度不易控制的问题，从而导致骨再生效果不佳。现临床应用的多为生物骨材料，其是将牛骨中的有机成分去除后提取三维异种碳酸盐磷灰石结晶体纯无机物，例如瑞士盖氏、美国欧司海斯公司提供的成品bio-oss人工骨骨粉；该骨粉成分较为单一，不含有任何有机成分，存在机械性能差、降解速度快的问题。

3、因此，寻求具有良好的机械性能及降解速度能够适用骨缺损填充，并能促进口腔成骨细胞增长的生物质材料，仍是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题及目的，本发明提出一种负载多种生长因子的骨胶原支架材料及其制备方法，将天然来源的动物骨处理得到的骨胶原支架，并负载多种生长因子，提升机械性能及骨诱导能力、延长降解时间，适用牙周炎治疗周期。具体技术方案如下：

2、首先，本发明提供一种负载多种生长因子的骨胶原支架材料，该骨胶原支架材料包括用于促进口腔成骨细胞增长的脱细胞基质及负载在该脱细胞基质上的多种生长因子；所述脱细胞基质为含有胶原蛋白的天然来源的动物骨得到的骨胶原支架；所述多种生长因子选自fgf、vegf、tgf-β、bmp中的两种或多种。

3、前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，所述骨胶原支架包含80wt％～98wt％胶原蛋白和2wt％～10wt％杂蛋白，其余为羟基磷灰石。

4、优选的，前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，所述骨胶原支架的蛋白总量为84.22wt％～98.53wt％。

5、进一步优选的，前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，所述骨胶原支架包含96.74wt％的胶原蛋白和1.79wt％的杂蛋白，其表面孔隙孔径为60～70μm。

6、前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，该骨胶原支架材料包含fgf、vegf、tgf-β、bmp四种生长因子，其负载量分别为：

7、fgf 20～27ng/g，

8、vegf 18～25ng/g，

9、tgf-β26～32ng/g，

10、bmp 24～30ng/g。

11、前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，该骨胶原支架材料的湿性抗压强度为0.0120～0.0221mpa，干性抗压强度为1.25～2.90mpa。

12、其次，本发明提供一种前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，包括如下步骤：

13、1)制备骨胶原支架：将动物骨表面脂肪去除后倒入清洗箱并放入恒温振荡器中进行脱脂，然后干燥粉碎并浸入蛋白酶溶液中浸泡30～60min，再放入酸性溶液中清洗8～10次后滤出，最后使用纯化水浸泡24～48h，沥干，冷冻干燥，得骨胶原支架；

14、2)生长因子负载：将步骤1)制备的骨胶原支架二次粉碎，粒径大小1～10μm，然后浸入生长因子溶液浸泡12～24h后，离心，弃上清，倒入模具冻干，包装后辐照灭菌，得到骨胶原支架材料。

15、作为优选的技术方案的，前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，步骤1)中，制备骨胶原支架，所述脱脂溶液溶液为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合液，脱脂参数为：温度：5～45℃；转速：300～600rpm；脱脂溶液溶液为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合液，料液比为1:3～5。

16、作为优选的技术方案的，前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，步骤1)中，制备骨胶原支架，所述酸性溶液为盐酸和/或磷酸，其浓度为0.5～1mol/l；所述纯化水浸泡温度为0℃，浸泡过程中每12h换一次纯化水，换水时检测其ph，以ph值为6～7.5合格。

17、作为优选的技术方案的，前述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，步骤2)中，所述生长因子负载，生长因子溶液的浓度为：

18、fgf：30～50ng/ml，

19、vegf：25～40ng/ml，

20、tgf-β：40～65ng/ml，

21、bmp：40～65ng/ml；

22、所述骨胶原支架加入生长因子溶液，料液比为1:5～10；

23、所述浸泡温度为0℃；

24、所述辐照灭菌的剂量为10～30kgy。

25、本发明的有益效果是：

26、1)本发明骨胶原支架材料，采用的骨胶原支架通过恒温振荡器洗涤脱脂，减少化学试剂的使用，并经过多次清洗试剂残留，具有更优的生物安全性；

27、2)本发明骨胶原支架材料，通过负载生长因子，提升骨诱导能力、延长降解时间；其中：fgf促进骨细胞合成胶原与非胶原，vegf有效促进成骨细胞的分化从而直接促进成骨，tgf-β使正常的成纤维细胞的表型发生变化，bmp对垂直骨缺损有效，骨诱导能力最强；四者联合使用，vegf、fgf促进血管生成；bmp-2、tgf-β通过调节成骨细胞的增殖、分化共同参与骨再生修复；vegf通过促进血管再生改善血液供应，增强bmp-2的骨诱导效果；tgf-β可上调vegf的表达并增强其活性，可与vegf、fgf、bmp-2共同调节骨修复再生的过程，达到促进骨再生的目的，且有新生血管参与，能达到更好的区域成骨效果。

28、3)本发明骨胶原支架材料，通过二次冻干，使胶原蛋白含量更高，能够更好促进骨再生，具有，并使骨胶原支架材料表面具有合适的的空隙孔径，使其更适合细胞攀爬，达到具有良好的机械性能及降解速度同时能够适用骨缺损填充，并能促进口腔成骨细胞增长目的。

29、4)本发明骨胶原支架材料，包装时低剂量辐照灭菌，在达到灭菌效果的同时不破坏生长因子结构，保证了产品的机械性能、及骨诱导能力和降解时间不受影响。

1.一种负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：该骨胶原支架材料包括用于促进口腔成骨细胞增长的脱细胞基质及负载在该脱细胞基质上的多种生长因子；

2.根据权利要求1所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：所述骨胶原支架包含80wt%～98wt%胶原蛋白和2wt%～10wt%杂蛋白，其余为羟基磷灰石。

3.根据权利要求2所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：所述骨胶原支架的蛋白总量为84.22wt%～98.53wt%。

4.根据权利要求3所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：所述骨胶原支架包含96.74wt%的胶原蛋白和1.79wt%的杂蛋白，其表面孔隙孔径为60～70μm。

5.根据权利要求1所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：该骨胶原支架材料包含fgf、vegf、tgf-β、bmp四种生长因子，其负载量分别为：

6.根据权利要求1所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料，其特征在于：该骨胶原支架材料的湿性抗压强度为0.0120～0.0221mpa，干性抗压强度为1.25～2.90mpa。

7.一种权利要求1-6任意一项所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中，制备骨胶原支架，所述脱脂溶液溶液为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合液，脱脂参数为：温度：5～45℃；转速：300～600rpm；脱脂溶液溶液为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合液，料液比为1:3～5。

9.根据权利要求7所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中，制备骨胶原支架，所述酸性溶液为盐酸和/或磷酸，其浓度为0.5～1mol/l；所述纯化水浸泡温度为0℃，浸泡过程中每12h换一次纯化水，换水时检测其ph，以ph值为6～7.5合格。

10.根据权利要求7所述的负载多种生长因子的骨胶原支架材料的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述生长因子负载，生长因子溶液的浓度为：