一种靶向挖掘乳酸菌蛋白质资源的方法

本发明涉及蛋白质基因组数据分析，尤其涉及一种靶向挖掘乳酸菌蛋白质资源的方法。

背景技术：

1、随着高通量dna测序技术的飞速发展，人类完成了越来越多的物种的基因组测序。基因组测序的目的是更加了解参与生物学功能的基因组成以及功能。因此，基因组注释的基本任务是确定基因与其他元件的位置和结构，并确定这些基因和元件具体的生物学功能。目前，这种基因组注释方法主要依赖于dna与rna序列信息；而相比于基因组或转录组注释，蛋白质组学则能够直接研究编码基因翻译出的蛋白质产物，因此蛋白质组学比基因组或转录组学注释基因组获得更直接的结果，同时蛋白质组学还可以发现由于知识不足导致的基因从头预测算法遗漏的基因和基因结构注释的错误，以及蛋白质存在的特有的翻译后修饰现象。

2、乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。乳酸菌不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料(在理论上具有重要的学术价值)，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域具有极高的应用价值。乳酸菌蛋白质参与了许多基本的生命过程，如能量代谢、信号传导等，因此乳酸菌蛋白质的研究具有重大的意义。然而，传统的乳酸菌蛋白质研究方法往往受限于技术的局限性和信息的碎片化，难以全面、深入地挖掘乳酸菌蛋白质资源。

3、近年来，随着高通量测序技术的飞速发展和生物信息学方法的不断完善，全基因组学和蛋白质组学已成为研究乳酸菌蛋白质的重要工具。全基因组学能够从基因组层面揭示乳酸菌的遗传信息和代谢途径，蛋白质组学则能够直接分析乳酸菌蛋白质的表达、结构和功能。但传统的蛋白质组学挖掘乳酸菌蛋白质的方法往往需要先通过电泳切胶进行质谱上机处理，再将下机数据与现有的蛋白数据库进行比对。这样不仅步骤繁琐，容易出错，并且受限于数据库中已知的蛋白质，对于乳酸菌中未知的蛋白质资源挖掘存在漏洞。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种联合全基因组学与蛋白质组学靶向挖掘乳酸菌蛋白质的方法，该方法不需要切胶处理单一的蛋白质，能够全面、深入地挖掘乳酸菌蛋白质资源，为乳酸菌学领域的研究提供新的思路和方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向挖掘乳酸菌蛋白质资源的方法，包括以下步骤：

4、(1)提取乳酸菌的dna，对乳酸菌进行全基因组测序；

5、(2)通过生物信息学方法预测乳酸菌含有的蛋白，并获取蛋白的氨基酸序列；

6、(3)提取乳酸菌的胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶，采用fasp法水解蛋白质，酶解后进行脱盐，分别获得胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶水解后的多肽；

7、(4)利用液相色谱预分离各多肽组分，对各多肽组分进行质谱鉴定，获得原始数据；

8、(5)利用鉴定和定量分析多肽和蛋白质的软件对所述原始数据进行分析，获得下机数据；

9、(6)将下机数据与数据库中乳酸菌已知的所有蛋白的氨基酸序列进行比对，鉴定出蛋白质的种类和序列。

10、优选的，步骤(2)所述蛋白包括含有信号肽的蛋白和含有跨膜螺旋的蛋白。

11、优选的，提取乳酸菌胞壁蛋白的步骤如下：将乳酸菌菌体与含有edta的磷酸盐缓冲液混合，于35～45℃水浴中孵育55～65min，离心后过滤膜，滤液即为粗胞壁蛋白酶液。

12、优选的，所述滤膜的孔径为0.2～0.25μm。

13、优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.08～0.12mmol/l，edta在磷酸盐缓冲液中的浓度为18～22mmol/l。

14、优选的，提取乳酸菌胞外蛋白的步骤如下：将乳酸菌培养上清液与硫酸铵混合，静置后离心，取沉淀物，将沉淀物置于0.01～0.03mol/l的磷酸盐缓冲液中溶解并透析，获得粗胞外蛋白液。

15、优选的，在乳酸菌培养上清液与硫酸铵混合后的溶液中，硫酸铵的浓度为饱和度的40～60％。

16、优选的，所述质谱鉴定的过程为：

17、使用0.08～0.12％甲酸/水溶液作为流动相a，75～85％乙腈/水溶液作为流动相b，流动相流速280～320nl/min，柱温为37～42℃；线性梯度洗脱参数为：0～5min，0～8％b；5～75min，8～32％b；75～77min，32～90％b；77～82min，90％b；82～85min，90～0％b；85～90min，0％b。

18、优选的，所述鉴定和定量分析多肽和蛋白质的软件包括proteome discoverer3.1。

19、优选的，所述数据库为uniprot数据库。

20、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明通过全基因组学技术，利用高通量测序技术对乳酸菌基因组进行全面测序和分析；然后提取乳酸菌的胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶，采用fasp法水解，对各多肽组分进行质谱鉴定，获得原始数据；利用软件对所述原始数据进行分析，获得下机数据；将下机数据与数据库中乳酸菌已知的所有蛋白的氨基酸序列进行比对，鉴定出蛋白质的种类和序列。本发明将全基因组学和蛋白组学结合对乳酸菌蛋白质进行挖掘，不仅能够快速、准确地分析乳酸菌蛋白质资源，提高挖掘的效率和准确性，还全面揭示乳酸菌蛋白质的分布和功能特性，为后续的深入研究提供基础。

1.一种靶向挖掘乳酸菌蛋白质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白包括含有信号肽的蛋白和含有跨膜螺旋的蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取乳酸菌胞壁蛋白的步骤如下：将乳酸菌菌体与含有edta的磷酸盐缓冲液混合，于35～45℃水浴中孵育55～65min，离心后过滤膜，滤液即为粗胞壁蛋白酶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.2～0.25μm。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.08～0.12mmol/l，edta在磷酸盐缓冲液中的浓度为18～22mmol/l。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，提取乳酸菌胞外蛋白的步骤如下：将乳酸菌培养上清液与硫酸铵混合，静置后离心，取沉淀物，将沉淀物置于0.01～0.03mol/l的磷酸盐缓冲液中溶解并透析，获得粗胞外蛋白酶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在乳酸菌培养上清液与硫酸铵混合后的溶液中，硫酸铵的浓度为饱和度的40～60％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱鉴定的过程为：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴定和定量分析多肽和蛋白质的软件包括proteome discoverer 3.1。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数据库为uniprot数据库。