一种固态发酵纳豆激酶制备纳豆粉的方法

本发明涉及一种固态发酵纳豆激酶制备纳豆粉的方法，属于微生物发酵。

背景技术：

1、血栓是引起脑卒中和冠心病的重要诱因，而伴随着老龄化社会的到来，血栓性疾病的患病人数预计会进一步增加，对我国居民生命健康和医疗经济带来极大的威胁。

2、血栓是由纤维蛋白和血小板大量凝固引起的一种疾病，它威胁着人类健康，并往往与中风、脑梗死和心肌梗死等其他一些疾病有关。纤溶酶已显示出对溶栓的强大作用，与其它微生物纤溶酶(尿激酶、链激酶)相比，纳豆激酶(nk)无副作用、成本较低且半衰期较长。此外，纳豆激酶在体内和体外都显示出溶栓活性，它不仅能直接降解纤维蛋白，还能刺激细胞释放组织纤溶酶原激活剂，进一步促进纤维蛋白的降解。

3、纳豆的保健功效很早就已被人们所认知。大豆经纳豆芽孢杆菌发酵后，产生一系列的生物和化学变化，使大豆的营养物质种类和含量都发生了改变，也使其营养价值得到提高。更重要的是，使纳豆具有了大豆所不具备的保健和医疗作用。纳豆激酶有点有很多：可以防治血栓、高血压、动脉硬化和便秘等疾病；有抗氧化和延缓衰老作用；具有神经保护作用；纳豆激酶具有增加骨骼密度，防治骨质疏松的作用；具有抗菌整肠作用；可以预防癌症；具有缓解更年期综合症的作用等。

4、目前纳豆激酶的生产主要包括液态发酵和固态发酵。液态发酵发酵周期短，物料消耗少，传质传热均匀，自动化程度高，发酵终点易于监测，但对发酵设备要求较高，投资成本大，能量消耗多，产生废液多，所产单位酶活普遍不及固态发酵高。固态发酵使用设备简单，操作要求低，能量消耗小，发酵原料普遍易得且价廉，所产单位酶活高，环境污染小。

5、但固态发酵容易受多种因素的影响，发酵程度与发酵基质物料比密切相关，反应进程复杂，菌体量测定困难，难以监控生产状态，生产周期受微生物生长速度影响大，营养物质传递和传热不均。产生的nk一般要经过分离纯化，主要分为粗分离与进一步纯化，粗分离的方法主要有对粗酶液进行离心、粗过滤、盐析、有机溶剂沉淀法等，对蛋白进行浓缩和初步纯化，再采用离子交换、亲和层析或凝胶渗透等进一步纯化，经过冷冻干燥得到nk纯品冻干粉。

6、专利cn113234627b使用枯草芽孢杆菌jnfe0127液态发酵制备纳豆激酶，其中添加苦荞粉的量为3％，发酵96h时酶活达到23326iu/ml；使用红芸豆和荞麦2：1复配发酵20h的发酵制品中，nk酶活达到30174iu/g。文献“苦荞对发酵豆乳纳豆激酶活力、风味及抗氧化活性的影响；食品与生物技术学报.2023,42(07)”公开了大豆、苦荞2：1发酵豆乳能够提高nk酶活、苦荞中的多酚提高豆乳抗氧化性、减少挥发性盐基氮含量。上述技术存在液态发酵纳豆激酶储存效果差、原材料成本过高、发酵营养物质单一等问题。

7、因此，开发一种低成本的、营养丰富且保持较高纳豆激酶酶活的产品具有极高的经济价值与实用价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明将豆粕和苦荞复配，使用转温发酵，制备得到的纳豆粉在具有高纳豆激酶酶活的基础上，进一步提高了大豆异黄酮的含量。

2、本发明的第一个目的是提供一种固态发酵制备纳豆粉的方法，包括如下步骤：

3、(1)将苦荞和豆粕分别按照质量比1：2～3与水混合、浸泡，调节ph为6～8，浸泡后苦荞和豆粕中含水量为50％～60％w/w；

4、(2)将苦荞、豆粕混合得到混合物，额外添加碳源、氮源和无机盐，灭菌制备得到固态培养基；

5、(3)固体培养基中接种bacillus subtilis jnfe0127，接种量为108～1010cfu/ml；接种后置于28～32℃、湿度为70％～80％的条件下发酵20～30h；再转移至38～42℃、湿度为60％～70％的条件下发酵7～9h；

6、(4)干燥发酵后的固体培养基，粉碎制备得到纳豆粉。

7、在一种实施方式中，豆粕为大豆榨油后的废弃产物。

8、在一种实施方式中，步骤(2)中碳源为蔗糖、氮源为胰蛋白胨、无机盐为0.01～0.1mol/l的氯化钾溶液。

9、在一种实施方式中，苦荞、豆粕混合时的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，蔗糖的添加量为2～2.5％w/w混合物，胰蛋白胨的添加量为1.0～2.0％w/w混合物，氯化钾溶液与混合物的用量比为1～5ml：40g。

10、在一种实施方式中，步骤(4)的干燥是冷冻干燥，步骤为：将发酵后的固体培养基置于-75～-85℃，预冻10～15h，转移至冷冻干燥机，-50～-60℃干燥48～72h。

11、在一种实施方式中，步骤(4)中粉碎制备得到的纳豆粉的粒径为60～80目。

12、本发明的第二个目的是提供任一上述方法制备得到的纳豆粉。

13、本发明的第三个目的是提供上述纳豆粉在制备纳豆激酶中的应用。

14、本发明的第四个目的是提供一种发酵产品，含有上述的纳豆粉；所述产品包括食品、保健品、药品。

15、在一种实施方式中，所述食品包括饲料、添加剂或饮品。

16、本发明的第五个目的是提供一种同时提高纳豆粉中大豆苷、燃料木苷和大豆异黄酮总量的方法，使用苦荞和豆粕固态发酵制备纳豆粉，所述固态发酵包括如下步骤：

17、(1)将苦荞和豆粕按照质量比1：2～3与水混合浸泡，调节ph为6～8，浸泡后苦荞和豆粕中含水量为50％～60％w/w；

18、(2)将苦荞、豆粕混合得到混合物，额外添加碳源、氮源和无机盐，灭菌制备得到固态培养基；

19、(3)固体培养基中接种bacillus subtilis jnfe0127，接种量为3～6％w/w(108～1010cfu/ml)；接种后置于28～32℃、湿度为70％～80％的条件下发酵20～30h，；再转移至38～42℃、湿度为60％～70％的条件下发酵7～9h；

20、(4)冷冻干燥发酵后的固体培养基，粉碎制备得到大豆苷、燃料木苷和大豆异黄酮总量提高的纳豆粉。

21、在一种实施方式中，步骤(2)中碳源为蔗糖、氮源为胰蛋白胨、无机盐为0.01～0.1mol/l的氯化钾溶液。

22、在一种实施方式中，苦荞、豆粕混合时的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，蔗糖的添加量为2～2.5％w/w混合物，胰蛋白胨的添加量为1.0～2.0％w/w混合物，氯化钾溶液与混合物的用量比为1～5ml：40g。

23、在一种实施方式中，步骤(4)的干燥是冷冻干燥，步骤为：将发酵后的固体培养基置于-75～-85℃，预冻10～15h，转移至冷冻干燥机，-50～-60℃干燥48～72h。

24、在一种实施方式中，步骤(4)中粉碎制备得到的纳豆粉的粒径为60～80目。

25、本发明的第六个目的是提供一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，包括如下步骤：

26、(1)将苦荞和豆粕按照质量比1：2～3与水混合浸泡，调节ph为6～8，浸泡后苦荞和豆粕中含水量为50％～60％w/w；

27、(2)将苦荞、豆粕混合得到混合物，额外添加碳源、氮源和无机盐，灭菌制备得到固态培养基；

28、(3)固体培养基中接种bacillus subtilis jnfe0127，接种量为3～6％w/w；接种后置于28～32℃、湿度为70％～80％的条件下发酵20～30h，；再转移至38～42℃、湿度为60％～70％的条件下发酵7～9h；

29、(4)冷冻干燥发酵后的固体培养基，粉碎制备得到纳豆粉，纯化得到纳豆激酶。

30、在一种实施方式中，步骤(2)中碳源为蔗糖、氮源为胰蛋白胨、无机盐为0.01～0.1mol/l的氯化钾溶液。

31、在一种实施方式中，苦荞、豆粕混合时的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，蔗糖的添加量为2～2.5％w/w混合物，胰蛋白胨的添加量为1.0～2.0％w/w混合物，氯化钾溶液与混合物的用量比为1～5ml：40g。

32、在一种实施方式中，步骤(4)的干燥是冷冻干燥，步骤为：将发酵后的固体培养基置于-75～-85℃，预冻10～15h，转移至冷冻干燥机，-50～-60℃干燥48～72h。

33、在一种实施方式中，步骤(4)中粉碎制备得到的纳豆粉的粒径为60～80目。

34、在一种实施方式中，未纯化的纳豆粉中纳豆激酶的酶活达到2481.21fu/g、94198.22iu/g(对干基)。

35、本发明的有益效果：

36、本发明将豆粕和苦荞复配，使用转温发酵，制备得到的纳豆粉在具有高纳豆激酶酶活的基础上，减少了挥发性盐基氮的含量、提高了抗氧化性、进一步提高了大豆异黄酮的含量等，具有多种活性功能。

37、具体的：

38、(1)本发明制备的纳豆粉中，纳豆激酶的酶活达到2481.21fu/g、94198.22iu/g(对干基)；

39、(2)与纳豆激酶酶活较高的配方，黄豆和豆粕(质量比4：1)相比，挥发性盐基氮的含量减少37.44％；

40、(3)本发明制备的纳豆粉具有较高的抗氧化性，与黄豆和豆粕(质量比4：1)相比，但总抗氧化能力和dpph自由基清除能力分别提高了54.9％、50％；

41、(4)本发明制备的纳豆粉具有较高的sod活力，与黄豆和豆粕(质量比4：1)相比，对sod活力提高了137.6％；

42、(5)本发明发酵前大豆异黄酮总含量为0.7384mg/g，转温发酵后大豆异黄酮总含量为1.3232mg/g，发酵后大豆异黄酮总含量升高79.19％；远高于利用黄豆和豆粕(质量比4：1发酵前后大豆异黄酮总含量升高39.94％)和黄豆和苦荞(质量比1：1发酵前后大豆异黄酮总含量升高35.24％)。