CRISPRV型系统的治疗应用的制作方法

1.一种治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括将以下引入到患有疾病或病状的患者的体细胞中：

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述体细胞中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中引起所述基因在所述体细胞中的表达增加。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pka介于6.1与6.7之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括固醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：dspc、dppc、popc、dope、sm、peg-dma、peg-dmg、dotma、dospa、dotap、dmrie、dc-胆固醇、dotap-胆固醇、gap-dmorie-dpype、gl67a-dope-dmpe-peg、98n12-5、c12-200、dlin-kc2-dma(kc2)、dlin-mc3-dma(mc3)、xtc、md1、7c1、peg-cerc14和peg-cerc20。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入到体细胞中是离体进行的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入到体细胞中是通过全身静脉内施用、施用到门静脉中或通过眼内施用进行的。

12.一种用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的治疗组合物，所述组合物包括：

13.根据权利要求12所述的组合物，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

14.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括第二核蛋白复合物，所述第二核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pka介于6.1与6.7之间。

17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。

18.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括固醇。

19.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：dspc、dppc、popc、dope、sm、peg-dma、peg-dmg、dotma、dospa、dotap、dmrie、dc-胆固醇、dotap-胆固醇、gap-dmorie-dpype、gl67a-dope-dmpe-peg、98n12-5、c12-200、dlin-kc2-dma(kc2)、dlin-mc3-dma(mc3)、xtc、md1、7c1、peg-cerc14和peg-cerc20。

20.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

21.一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括

22.根据权利要求21所述的方法，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

23.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

25.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述ipsc中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。

31.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

32.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。

36.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松(dexamethasone)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他(vorinostat))和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰(scriptaid)、苏拉明钠(suramin sodium)、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素(apicidin)、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b(trapoxin b)、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林(n-acetyl dinaline))和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛(tubacin)、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。

37.根据权利要求21所述的方法，其中所述ipsc分化为神经元。

38.根据权利要求33所述的方法，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡(dorsomorphin)、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白(sonichedgehog protein)、嘌莫啡胺(purmorphamine)、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白(nestin)、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。

40.根据权利要求33所述的方法，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

41.根据权利要求21所述的方法，其中所述ipsc分化为肌细胞。

42.根据权利要求37所述的方法，其中通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。

43.根据权利要求37所述的方法，其中所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

44.一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的组合物，所述组合物包括ipsc，所述ipsc包括：

45.根据权利要求44所述的组合物，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

46.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

48.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。

51.根据权利要求44所述的组合物，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。

53.根据权利要求44所述的组合物，其中所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。

56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。

57.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。

58.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。

59.根据权利要求53所述的组合物，其中所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林)和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。

60.根据权利要求44所述的组合物，其中所述ipsc分化为神经元。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。

62.根据权利要求60所述的组合物，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。

63.根据权利要求60所述的组合物，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

64.根据权利要求44所述的组合物，其中所述ipsc分化为肌细胞。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

67.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

68.一种制备用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括

69.根据权利要求68所述的方法，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

70.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

72.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述ipsc中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。

75.根据权利要求68所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。

77.根据权利要求68所述的方法，其中所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

79.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。

80.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。

81.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。

82.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。

83.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b(trapoxin b)、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林(n-acetyldinaline))和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。

84.根据权利要求68所述的方法，其中所述ipsc分化为神经元。

85.根据权利要求84所述的方法，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。

87.根据权利要求85所述的方法，其中所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

88.根据权利要求68所述的方法，其中所述ipsc分化为肌细胞。

89.根据权利要求88所述的方法，其中通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。

90.根据权利要求88所述的方法，其中所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

91.一种制备用于异种移植的转基因动物的方法，所述方法包括：

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。

93.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物的细胞是体细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(1)之后，将所述细胞的核转移到去核卵子或受精卵中。

94.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物是猪。

95.根据权利要求91所述的方法，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

96.根据权利要求91所述的方法，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

98.根据权利要求91所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：a20、ho-1、fat-1、tnf-α受体、cd39、水蛭素、tfpi、epcr、tbm、cd46、daf(cd55)、cd59、cr1、ctla4、cd47、i类hla中的一个或多个i类hla。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。

101.根据权利要求91所述的方法，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：ggta1、b4galnt2、cmah、gt(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、ghr、i类sla中的一个或多个i类sla。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。

103.一种用于制备用于异种移植的转基因动物的组合物，所述组合物包括动物细胞，所述动物细胞包括：

104.根据权利要求103所述的组合物，其中动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。

105.根据权利要求103所述的组合物，其中所述动物的细胞是由将体细胞的核转移到去核卵子或受精卵中而产生的卵子或受精卵。

106.根据权利要求103所述的组合物，其中所述动物是猪。

107.根据权利要求103所述的组合物，其中在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

108.根据权利要求103所述的组合物，其进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

109.根据权利要求108所述的组合物，其中所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

110.根据权利要求103所述的组合物，其进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：a20、ho-1、fat-1、tnf-α受体、cd39、水蛭素、tfpi、epcr、tbm、cd46、daf(cd55)、cd59、cr1、ctla4、cd47、i类hla中的一个或多个i类hla。

111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。

112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。

113.根据权利要求103所述的组合物，其中所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：ggta1、b4galnt2、cmah、gt(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、ghr、i类sla中的一个或多个i类sla。

114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。