CRISPRV型系统的治疗应用的制作方法

本公开总体上涉及利用用成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)系统，更具体地crispr-cas12系统修饰的细胞的细胞疗法领域。

背景技术：

1、成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)蛋白系统存在于许多原核生物的基因组中，并且提供针对病毒的适应性免疫。可以在makarova等人中找到各种crispr-cas系统在其天然宿主(1类i型；2类ii和v型)、rna靶向(2类vi型)以及dna和rna联合靶向(1类iii型)方面的最新描述和分类(《自然综述：微生物学(nat.rev.microbiol.)》,2020,18:67-83)。尤其感兴趣的是v型系统，其包含不同的亚型，例如，v-a、v-b、v-c、v-d、v-e、v-f、v-g、v-h、v-i、v-j、v-k和v-u。v-a亚型编码cas12a蛋白(以前被称为cpf1)。cas12a具有与cas9的相应结构域同源的ruvc样核酸酶结构域但缺少hnh核酸酶结构域。

2、已经在若干种细菌中发现v型系统，所述细菌包含俭菌超门细菌(parcubacteriabacterium)gwc2011_gwc2_44_17(pbcpf1)、毛螺菌科细菌(lachnospiraceae bacterium)mc2017(lb3 cpf1)、解蛋白丁酸弧菌(butyrivibrio proteoclasticus)(bpcpf1)、异域菌门细菌(peregrinibacteria bacterium)gw2011_gwa_33_10(pecpf1)、氨基酸球菌(acidaminococcus sp.)bv3l6(ascpf1)、猕猴卟啉单胞菌(porphyromonas macacae)(pmcpf1)、毛螺菌科细菌nd2006(lbcpf1)、狗口腔卟啉单胞菌(porphyromonascrevioricanis)(pccpf1)、解糖胨普雷沃氏菌(prevotella disiens)(pdcpf1)、牛眼莫拉氏菌(moraxella bovoculi)237(mbcpf1)、史密斯氏菌属(smithella sp.)sc_k08d17(sscpf1)、稻田氏钩端螺旋体(leptospira inadai)(licpf1)、毛螺菌科细菌ma2020(lb2cpf1)、新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)u112(fncpf1)、候选白蚁甲烷支原体(candidatus methanoplasma termitum)(cmtcpf1)和挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)(eecpf1)。

3、crispr-cas系统提供了用于通过缺失、插入、突变或取代特定核酸序列进行定点基因组编辑的强大工具。改变可能是基因特异性的或位置特异性的。基因组编辑可以使用定点核酸酶(如cas蛋白和其同源多核苷酸)来切割靶核酸，由此产生用于改变的位点。在某些情况下，切割可以在靶dna序列中引入双链断裂(dsb)。dsb可以例如通过非同源端接合(nhej)、微同源介导的端接合(mmej)或同源定向修复(hdr)进行修复。hdr依赖于模板的存在进行修复。在这种基因组编辑的一些实例中，供体多核苷酸或其部分可以插入到断裂中。

技术实现思路

1、这种利用v型crispr-cas蛋白(如cas12a)与crispr杂交rna-dna向导(chrdna)组合的基因组编辑方法对于产生可用于治疗应用的经基因修饰的细胞来说尤其有用。

2、在一些实施例中，本发明是一种治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括将以下引入到患有疾病或病状的患者的体细胞中：(a)第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；以及(b)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括在患有所述疾病或病状的个体中异常表达的基因靶的编码序列；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中，并且其中所述引入是通过使所述体细胞与包括所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸的脂质纳米颗粒接触进行的，并且其中所述基因靶选自表3。在一些实施例中，在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述体细胞中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

3、在一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中引起所述基因在所述体细胞中的表达增加。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pka介于6.1与6.7之间。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括固醇。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：dspc、dppc、popc、dope、sm、peg-dma、peg-dmg、dotma、dospa、dotap、dmrie、dc-胆固醇、dotap-胆固醇、gap-dmorie-dpype、gl67a-dope-dmpe-peg、98n12-5、c12-200、dlin-kc2-dma(kc2)、dlin-mc3-dma(mc3)、xtc、md1、7c1、peg-cerc14和peg-cerc20。

4、在一些实施例中，所述引入到体细胞中是离体进行的。在一些实施例中，所述引入到体细胞中是通过全身静脉内施用、施用到门静脉中或通过眼内施用进行的。

5、在一些实施例中，本发明是一种用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的治疗组合物，所述组合物包括：(a)第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；以及(b)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括在患有所述疾病或病状的个体中异常表达的基因靶的编码序列；其中所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸存在于脂质纳米颗粒中，并且其中所述基因靶选自表3。在一些实施例中，在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

6、在一些实施例中，所述组合物进一步包括第二核蛋白复合物，所述第二核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸。在所述组合物的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pka介于6.1与6.7之间。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括固醇。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：dspc、dppc、popc、dope、sm、peg-dma、peg-dmg、dotma、dospa、dotap、dmrie、dc-胆固醇、dotap-胆固醇、gap-dmorie-dpype、gl67a-dope-dmpe-peg、98n12-5、c12-200、dlin-kc2-dma(kc2)、dlin-mc3-dma(mc3)、xtc、md1、7c1、peg-cerc14和peg-cerc20。在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载剂。

7、在一些实施例中，本发明是一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到ipsc中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；(2)在患有所述疾病或病状的个体中将所述ipsc分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型；以及(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的ipsc。在一些实施例中，在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

8、在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述ipsc中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述方法的一些实施例中，所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。在所述方法的一些实施例中，所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松(dexamethasone)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他(vorinostat))和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰(scriptaid)、苏拉明钠(suramin sodium)、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素(apicidin)、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b(trapoxin b)、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林(n-acetyl dinaline))和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛(tubacin)、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。在所述方法的一些实施例中，所述ipsc分化为神经元。在所述方法的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡(dorsomorphin)、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白(sonic hedgehog protein)、嘌莫啡胺(purmorphamine)、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白(nestin)、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

9、在所述方法的一些实施例中，其中所述ipsc分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

10、在一些实施例中，本发明是一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的组合物，所述组合物包括ipsc，所述ipsc包括：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；并且所述ipsc能够在患有所述疾病或病状的个体中分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型。在所述组合物的一些实施例中，crispr向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述组合物的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。在所述组合物的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述组合物的一些实施例中，所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。在所述组合物的一些实施例中，所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述组合物的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述组合物的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。在所述组合物的一些实施例中，其中所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b(trapoxin b)、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林(n-acetyldinaline))和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。

11、在所述组合物的一些实施例中，所述ipsc分化为神经元。在所述组合物的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。在所述组合物的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述组合物的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

12、在所述组合物的一些实施例中，所述ipsc分化为肌细胞。在所述组合物的一些实施例中，通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。在所述组合物的一些实施例中，所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

13、在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载剂。

14、在一些实施例中，本发明是一种制备用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到ipsc中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；(2)在患有所述疾病或病状的个体中将所述ipsc分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型；以及(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的ipsc。在所述方法的一些实施例中，所述crispr向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述ipsc中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述ipsc的基因组中引起所述基因在所述ipsc中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述ipsc的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述方法的一些实施例中，所述ipsc的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述ipsc中的表达减少。在所述方法的一些实施例中，所述ipsc是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mrna引入到所述体细胞中进行的。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因选自oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、sox1、sox3、sox15、sox18、klf1、klf2、klf5、nr5a2、c-myc、l-myc、n-myc、rem2、tert、lin28和wnt。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2、klf4和c-myc的组合组成。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由oct4、sox2和nanog的组合组成。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程进一步包括使所述ipsc与以下中的一者或多者接触：mek抑制剂、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha(例如，mk0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、bml-210、depudecin(例如，(-)-depudecin)、hc毒素、nullscript(4-(1,3-二氧代-1h,3h-苯并[de]异喹啉-2-基)-n-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((vp a)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素a(tsa)、apha化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(pivanex，an-9)、曲普欣b、chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为fr901228或fk228)、苯甲酰胺(例如，ci-994(例如，n-乙酰基地那林)和ms-27-275)、mgcd0103、nvp-laq-824、cbha(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、jnj16241199、吐巴辛(tubacin)、a-161906、proxamide、oxamflatin、3-c1-ucha(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、aoe(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、chap31和chap50。

15、在所述方法的一些实施例中，所述ipsc分化为神经元。在所述方法的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为神经元：gsk-3抑制剂、tgf-β受体或tgf-β抑制剂、alk抑制剂、多索吗啡、化合物e、fgf、egf、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、sag二盐酸盐、cntf和gdnf。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量sox1、pax6、巢蛋白、hb9、map2、神经丝、tuj1和olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

16、在所述方法的一些实施例中，其中所述ipsc分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，通过在存在gsk-3抑制剂和wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述ipsc来将所述ipsc分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，所述将ipsc分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量tbx5、tnnt2、myh6和myl7中的一者或多者的表达来评估的。

17、在一些实施例中，本发明是一种制备用于异种移植的转基因动物的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到动物的细胞中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰；(2)将所述细胞引入到寄养雌性动物体内。在所述方法的一些实施例中，动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。在所述方法的一些实施例中，所述动物的细胞是体细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(1)之后，将所述细胞的核转移到去核卵子或受精卵中。在所述方法的一些实施例中，所述动物是猪。在所述方法的一些实施例中，在所述crispr向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：a20、ho-1、fat-1、tnf-α受体、cd39、水蛭素、tfpi、epcr、tbm、cd46、daf(cd55)、cd59、cr1、ctla4、cd47、i类hla中的一个或多个i类hla。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：ggta1、b4galnt2、cmah、gt(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、ghr、i类sla中的一个或多个i类sla。在所述方法的一些实施例中，所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。

18、在一些实施例中，本发明是一种用于制备用于异种移植的转基因动物的组合物，所述组合物包括动物细胞，所述动物细胞包括：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括cas12a蛋白和第一crispr向导分子，所述第一crispr向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰。在所述组合物的一些实施例中，动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。在所述组合物的一些实施例中，所述动物的细胞是由将体细胞的核转移到去核卵子或受精卵中而产生的卵子或受精卵。在所述组合物的一些实施例中，所述动物是猪。在所述组合物的一些实施例中，所述crispr向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括将包括cas12a蛋白和第二crispr向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述ipsc中，所述第二crispr向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述组合物的一些实施例中，所述第二crispr向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：a20、ho-1、fat-1、tnf-α受体、cd39、水蛭素、tfpi、epcr、tbm、cd46、daf(cd55)、cd59、cr1、ctla4、cd47、i类hla中的一个或多个i类hla。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。在所述组合物的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：ggta1、b4galnt2、cmah、gt(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、ghr、i类sla中的一个或多个i类sla。在所述组合物的一些实施例中，所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。