基于DNA水凝胶分离和检测肿瘤来源外泌体的试剂盒及其应用

本发明属于生物，尤其涉及一种基于dna水凝胶分离和检测肿瘤来源外泌体的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、外泌体因其在各种病理生理过程，特别是疾病发生发展中起着重要的作用而被广泛研究。被认为是疾病诊断和治疗监测的重要生物标志物。然而，小尺寸(30～150nm)的外泌体分离分析仍然是一个挑战。传统的外泌体分离方法包括超速离心、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀等方法。这些方法存在耗时长、操作繁琐、需要大型仪器且分离的外泌体纯度不高等缺点。目前发展了基于膜过滤、温度敏感型聚合物等分离方法，这些方法对于特定的外泌体亚种群分离分析(肿瘤相关的外泌体)仍然是一个挑战。还发展了利用抗体和核酸适配体构建免疫亲和的方法用于外泌体的分离分析，这些方法只能够分离和分析非特异性的外泌体，对于肿瘤来源的特异性外泌体的分离和分析仍然是一个难题，尤其是复杂临床样本中大量正常细胞源性外泌体的干扰下，低丰度肿瘤来源的外泌体的分离分析仍然是一个未满足的需求。因此发展简单快速，能够分离和检测特异性肿瘤来源外泌体的方法是十分有必要的。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种基于dna水凝胶分离和检测肿瘤来源外泌体的试剂盒及其应用。基于dna水凝胶分离和检测肿瘤来源外泌体的试剂盒，该方法操作简单，无需大型的仪器设备，生物相容性好，能够分离出特异性的肿瘤来源外泌体，而且分离的外泌体具有良好的生物活性可用于后续的分析和应用。该方法也可用于其它细胞来源的外泌体的分离和分析。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于dna水凝胶分离的检测肿瘤来源外泌体的试剂盒，包括t1 aptamer、t2 aptamer、h1、h2、引发剂；

3、所述t1 aptamer的基因序列为aptamer1-t15-trigger1，所述trigger1的基因序列如seq id no.1所示，所述aptamer1为特异结合肿瘤外泌体上表面蛋白的aptamer序列；

4、所述t2 aptamer的基因序列为aptamer2-t15-trigger2，所述trigger2的基因序列如seq id no.2所示，所述aptamer2为特异结合肿瘤外泌体上表面蛋白的aptamer序列；

5、所述h1的基因序列如seq id no.3所示；

6、所述h2的基因序列如seq id no.4所示；

7、在所述h1的一端连接有海藻酸钠。

8、上述的试剂盒，进一步的，所述引发剂为钙离子。

9、上述的试剂盒，进一步的，所述t1 aptamer和t2 aptamer的浓度比为1﹕1；所述h1和h2的浓度比为1﹕1。

10、上述的试剂盒，进一步的，所述引发剂的浓度为1mm。

11、上述的试剂盒，进一步的，还包括edta，所述edta的浓度为5mm。

12、上述的试剂盒，进一步的，所述t1 aptamer为cd63-t1 aptamer，所述cd63-t1aptamer的基因序列如seq id no.5所示；所述t2 aptamer为epcam-t2 aptamer，所述epcam-t2aptamer的基因序列如seq id no.6所示。

13、基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述试剂盒在制备检测肿瘤来源外泌体的试剂盒中的应用。

14、上述的应用，进一步的，所述应用的方法包括以下步骤：

15、s1、在外泌体的表面形成带有海藻酸盐的杂交链式反应纳米结构，形成外泌体-杂交链式反应纳米结构-海藻酸盐的复合物；

16、s2、加入钙离子作为水凝胶形成的引发剂，将外泌体包裹在dna水凝胶中；

17、s3、离心分离，检测分离的外泌体的荧光信号。

18、基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述试剂盒在制备检测肿瘤来源外泌体的分离试剂盒中的应用。

19、上述的应用，进一步的，所述应用的方法还包括：

20、s1、在外泌体的表面形成带有海藻酸盐的杂交链式反应纳米结构，形成外泌体-杂交链式反应纳米结构-海藻酸盐的复合物；

21、s2、加入钙离子作为水凝胶形成的引发剂，将外泌体包裹在dna水凝胶中；

22、s3、离心分离，检测分离的外泌体的荧光信号；

23、s4、加入乙二胺四乙酸，使水凝胶变成溶胶实现外泌体的释放。

24、与现有技术相比，本发明的优点在于：

25、(1)本发明提供了一种基于dna水凝胶分离的检测肿瘤来源外泌体的试剂盒，克服了目前外泌体分离和检测耗时耗力的缺点，将包裹了外泌体的水凝胶通过简单手动离心分离和荧光检测。

26、(2)本发明提供了一种试剂盒在分离和检测肿瘤来源外泌体的应用，该方法操作简单，无需大型的仪器设备，能够分离出特异性的肿瘤来源外泌体，而且分离的外泌体具有良好的生物活性可用于后续的分析和应用。该方法也可用于其他细胞来源的外泌体的分离和检测。

1.一种基于dna水凝胶分离的检测肿瘤来源外泌体的试剂盒，其特征在于，包括t1aptamer、t2 aptamer、h1、h2、引发剂；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂为钙离子。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述t1 aptamer和t2 aptamer的浓度比为1﹕1；所述h1和h2的浓度比为1﹕1；所述引发剂的浓度为1mm。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括edta，所述edta的浓度为5mm。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述t1 aptamer为cd63-t1aptamer，所述cd63-t1 aptamer的基因序列如seq id no.5所示；

6.一种权利要求1至5中任一项所述试剂盒在制备检测肿瘤来源外泌体的试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：

8.一种权利要求1至5中任一项所述试剂盒在制备检测肿瘤来源外泌体的分离试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述应用的方法还包括：