一种解磷土曲霉及其在抗旱益生中的应用的制作方法

本发明属于微生物，特别涉及一种解磷土曲霉及其在抗旱益生中的应用。

背景技术：

1、干旱作为目前全球农业生产面临的自然灾害之一，仅仅依赖于植物自身应对干旱的生理响应开发作物抗旱策略是远远不够的，关注干旱胁迫下适应性微生物的定殖以及微生物对植物的有益协助，对改善植物生长并提高作物抗旱能力具有重要的指导意义。其中，与植物紧密互作的根际微生物在植物健康发育和胁迫耐受性方面发挥着重要作用，具备良好的应用潜力。挖掘与植物高抗旱能力相关的潜在微生物并充分发挥其作用，探寻与耐旱植物存在有益协作关系的微生物并加以利用，通过调控植物根际微生物组的角度充分发挥根际微生物在增强作物抗旱性中的作用，为全球气候变暖背景下的抗耐旱农业应用提供新的解决思路。

2、根际促生真菌（pgpf）是根际土壤中与植物相关的非致病性丝状真菌，能促进植物生长。与pgpb相比，pgpf受到的关注较少，根据目前研究，pgpf和 pgpf具有相同的植物促生作用和相似的作用机制。面对干旱胁迫，pgpf主要通过分泌赤霉素和iaa等植物激素改变植物体内营养物质分配、合成铁载体、增加抗氧化酶活性、减少脂质过氧化、积累可溶性糖和脯氨酸等渗透物等方式调节植物抗旱性。其中，很多研究已证实常见的曲霉属（ aspergillus）、青霉属（ penicillium）、木霉属（ trichoderma）、茎点霉属（ phoma）等真菌以及amf在调控植物应对干旱过程中起到了关键作用。中国发明专利cn202210880877.9公开了土曲霉酮浸种处理能够在缺水条件下促进植株根长和苗高，显著提高农作物产量，可见，这也是产土曲霉酮菌株调控农作物耐旱的机制之一。然而，土曲霉酮价格不菲，使其在农业生产中应用受到很大的限制。因此，挖掘具有产土曲霉酮、分泌对植物有益的代谢物的微生物菌株资源，研发含有多种益生功能代谢物的活菌制剂并应用于提升作物抗旱性能将具有巨大的应用潜力。

3、同时，我国有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用。施入的磷肥当季作物利用率为5%-25%，大部分磷与土壤中的ca2+、fe3+、fe2+、al3+结合，形成难溶性磷酸盐。缺磷会导致作物多种代谢过程受到抑制，植株生长缓慢，叶片变小，叶色暗绿或淡绿，缺乏光泽，植株矮小，果实发育商品性严重下降。土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷、钾转化为可吸收利用的形态，增强植物对土壤中磷、钾元素的摄取。目前，对解磷解钾微生物的开发以细菌居多，如巨大芽孢杆菌等，解磷真菌的种类虽然不多，主要有青霉、曲霉和根霉，但解磷真菌的解磷能力要比解磷细菌的强且遗传性状稳定。中国发明专利202010112793.1埋藏曲霉（ aspergillus sepultus）mn114011对于浓度高达20%的难溶性磷源具有显著的解磷效果，可以有效提高有效磷的含量，增强土壤磷的利用率，同时能够促进作物增产，埋藏曲霉处理后的玉米作物根系得到明显增强，具有显著的促进作物生长的作用，可制备解磷剂和生长促进剂。中国发明专利202210452947.0公开了一株具有高效解磷解钾特性的日本曲霉( aspergillus japonicus)，菌株在液体摇瓶培养情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸镁和磷酸铝具有极强的溶解效果。中国发明专利201210235182.1公开了一种根际解磷真菌泡盛曲霉（ aspergillus awamori）jp-nj1菌剂能够明显促进马尾松苗木的生长。

4、我国旱地面积占全国总土地面积的52.5%，主要分布在我国东北、华北和西北地区。农业生产条件不稳定的半干旱地区占国土面积的21.7%，其年降雨量在300-550mm左右，在我国农业生产中占有重要地位，是解决未来中国粮食问题的希望之寄托。目前关于高效解磷土曲霉及其耐旱方面的研究在国内还未见相关报道。

5、因此，从干旱贫磷的根际土壤选育出的耐旱高效解磷真菌，不但对调节土壤磷素供需矛盾，改善寒冷干旱地区保持土壤肥力，促进作物生长具有重要意义，且不存在生物安全隐患。

技术实现思路

1、针对我国广大耕地面临的干旱和贫磷问题，补充现有技术的不足，本发明提供一种解磷土曲霉及其在抗旱益生中的应用，进一步，本发明具备解磷、防病、提高作物耐旱能力、促进农作物生长的土曲霉菌剂及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明第一个方面公开了一株高产土曲霉酮、解磷、抗土传镰孢菌土曲霉菌，土曲霉cy-05（ aspergillus terreus cy-05），已于2023年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为cctcc no m 20231662，保藏地址：中国武汉，武汉大学。

3、本发明所述的土曲霉菌从辽西半干旱区连作辣椒土壤中经过筛选获得，编号为cy-05；所述菌株cy-05接种至含pda培养基中，置于28-30℃恒温培养保存。

4、土曲霉cy-05对辣椒根腐病病原菌（ fusarium solani）、辣椒菌核病病原菌（ sclerotinia sclerotium）、和立枯丝核菌（ rhizoctonia solaini）等多种辣椒土传病害病原菌具有广谱抗菌性，抑菌率为21.57%-50.59%；几丁质酶活和β-1,3葡聚糖酶活分别为2.116u/ml和0.354u/ml，对病原真菌具有抑菌能力。

5、土曲霉cy-05具有高效的解磷能力，降解无机磷的能力可达66.392mg/l，从而活化根际土壤中无机磷元素，对作物生长具有促进作用。

6、土曲霉cy-05具有高产土曲霉酮能力，土曲霉酮产量可达2227.963pg/g。

7、本发明第二个方面公开了一种菌剂，所述菌剂含有权利要求1所述的土曲霉菌和/或所述土曲霉菌的代谢物。

8、所述菌剂经固体发酵获得。

9、所述菌株经活化后于pda茄瓶斜面培养5d，无菌生理盐水洗脱孢子，并调节悬浮液中孢子浓度达到1.0×107-1.0×108cfu/ml，作为种子液；将孢子悬浮液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂。

10、上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。

11、上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为粉剂或颗粒剂。

12、根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。

13、本发明第四个方面公开上述菌剂的制备方法，将所述菌株经活化后pda在茄瓶斜面培养5d，无菌生理盐水调节悬浮液中孢子浓度达到1.0×107-1.0×108cfu/ml，作为种子液。将种子液接种于固体培养基中经两次发酵，即得菌剂；其中，固体培养基为物料和水，料水质量比1:0.5；其中，其中，物料以重量份计，各组分包括5份稻壳粉、35份稻壳、35份麸皮、15份玉米粉、10份豆粕粉、无机盐（硫酸铵和磷酸二氢钾）。

14、优选地，制备方法的具体过程为：1）活化菌株：将土曲霉点接种到pda平板中，置于培养箱28-30℃恒温培养5-7天；

15、2）制备种子液：将步骤1）中制备的土曲霉菌的菌落接种于pda茄瓶斜面培养基中，在28-30℃条件下培养4-5h，无菌生理盐水冲洗并调节孢子浓度1.0×107-1.0×108cfu/ml，即为种子液；

16、3）固体发酵制备菌剂：将步骤2）中制备的种子液，将种子液接种于固体培养料中，其中种子液与固体培养料的体积质量比为5-10%，在28-30℃条件下培养5-6d，此时菌体布满发酵料，而后再置于20-28℃（室温下）进行二次发酵（产孢发酵）3-5d，阴干即得富含孢子且适于长时间保存的微生物菌剂。

17、通过上述制备方法，本发明微生物菌剂的有效活菌数量达43.16×109cfu/g。

18、本发明第五个方面公开了上述土曲霉菌的培养物，具体包括上述的土曲霉菌在培养基中培养得到的物质，包括代谢物，如有机酸或其他离子化合物。

19、术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物（培养容器内的所有物质）的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

20、术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

21、本发明第六个方面公开了上述土曲霉菌cy-05、土曲霉菌菌剂或土曲霉菌培养物在如下至少一种中的应用：

22、1）溶磷；

23、2）抑制辣椒土传病害病原菌；

24、3）产土曲霉酮；

25、4）提升植物抗旱性；

26、5）促进植物成长。

27、其中抑制辣椒土传病害病原菌为在抗土传病害病原菌用于蔬菜病害防控；所述辣椒土传病害病原菌包括辣椒根腐病病原菌、辣椒菌核病病原菌和立枯丝核菌；

28、其中溶磷是指分解难利用的无机磷用于活化土壤肥力促进植物生长；

29、其中产土曲霉酮可以协助作物耐旱；

30、其中，促进植物生长体现为如下中的全部或部分：

31、1）在干旱胁迫下促进植物产量增加；

32、2）在干旱胁迫下促进植物地上部生物量增加。

33、本发明第七个方面公开了一种提高植物抗旱能力或促进植物生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：在干旱胁迫条件下，对受试植物施用权利要求1所述的土曲霉菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物，从而提高植物抗旱能力或促进植物生长；所述植物包括但不限于辣椒和玉米等作物。

34、其中盆栽试验应用中，在辣椒定殖前将菌剂施于辣椒苗下，剂量为1.0-5.0g每株，之后按常规操作定殖栽培管理并于生长季结束后统计产量和地上部生物量。

35、本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

36、本发明的土曲霉菌是辣椒根际土壤中筛选获得，避免生物安全问题的担忧，土曲霉菌cy-05是一株具有抗病、高产土曲霉酮和解磷能力的促生功能微生物菌株，且具备提高作物耐旱等多功能于一身的存活力超强的优良菌株。土曲霉菌剂施用可以增加作物对干旱的耐受性，干旱胁迫条件下促进作物生长发育、提高产量、提升存活能力，促进难溶磷素的转化和利用，预防根部土传病害的发生。菌株cy-05来自辣椒根际土壤，对人畜无毒无害，不造成环境污染，且其菌株发酵的培养物具有益生和协助作物抗旱功能有助于解决广大半干旱种植地区（新疆、陕西、内蒙古）农业生产中面临的水分匮缺问题，具有重要的经济意义。