一种细胞外囊泡保护剂及其应用的制作方法

本发明属于外泌体，具体涉及一种细胞外囊泡保护剂及其应用。

背景技术：

1、外泌体(exosomes)是细胞分泌的小型膜囊泡，直径约30-150纳米，近年来在生物医学研究中引起了广泛关注。研究发现外泌体在各种正常的生理过程和疾病进程中发挥着各种各样功能，得益于其低免疫原性和靶向性，在疾病治疗方面展现了良好的临床应用潜力。

2、然而，关于外泌体储存条件的研究较少，缺乏标准化的外泌体储存条件。目前常用的-80℃条件，不同的保存缓冲液中外泌体保存稳定性差异很大，有研究显示(a etal.,identification of storage conditions stabilizing extracellular vesiclespreparations.j extracell vesicles.2022jun；11(6):e12238.doi:10.1002/jev2.12238.pmid:35716060；pmcid:pmc 9206228.)，

3、保护效果差的缓冲液中外泌体在1.5个月时浓度下降超过一半，保存效果并不理想。另外，-80℃保存条件比较苛刻，对于运输和长期保存来说是很大的挑战，严重制约外泌体在临床中的应用。因此，迫切需要开发一个稳定的处方，使高浓度外泌体可以在冷藏(2-8℃)或常温下保存、运输，并且可以耐多次冻融。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种不仅适合-80℃、2-8℃以溶液形式保存，而且适合冻干的细胞外囊泡保存制剂。

2、为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供一种细胞外囊泡保护剂。

4、进一步，所述保护剂由缓冲体系和冻干稳定剂组成，所述冻干稳定剂包括表面活性剂和/或糖类物质。

5、进一步，所述缓冲体系包括tris-nacl缓冲剂、pbs缓冲剂、枸橼酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、nacl溶剂。

6、进一步，所述tris-nacl缓冲剂中tris和nacl浓度分别为20mm和137mm。

7、进一步，所述缓冲体系提供6.0～8.0的溶液ph。

8、优选地，所述缓冲体系为pbs缓冲剂。

9、优选地，所述pbs缓冲剂提供7.3的溶液ph。

10、进一步，所述表面活性剂包括吐温、dmso、f68。

11、优选地，所述表面活性剂为f68。

12、优选地，所述f68在缓冲体系中的终浓度为0.005％。

13、进一步，所述糖类物质包括海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、棉子糖、果糖、麦芽糖。

14、优选地，所述糖类物质为蔗糖。

15、优选地，所述蔗糖在缓冲体系中的终浓度为1.5％。

16、进一步，所述保护剂为pbs缓冲剂与f68和蔗糖的组合。

17、进一步，所述保护剂为pbs缓冲剂与f68的组合。

18、优选地，所述f68、蔗糖在pbs缓冲剂中的终浓度分别为0.005％和1.5％。

19、术语“细胞外囊泡”应理解为涉及可从细胞以任何形式获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自内溶酶体途径的任何囊泡)、凋亡小体(例如可从凋亡细胞获得)、微粒(可源自例如血小板)、核外颗粒体(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(例如可从前列腺癌细胞获得)或心脏小体(例如可从心脏细胞获得)等。细胞外囊泡的大小可以相差很大，但是细胞外囊泡通常具有纳米级的流体动力学直径，即直径小于1000nm。显然，细胞外囊泡可以源自体内、离体和体外的任何细胞类型。优选的细胞外囊泡包括外泌体和微囊泡，但是其它细胞外囊泡在各种情况下也可以是有利的。此外，所述术语还应理解为涉及细胞外囊泡模拟物、通过例如膜挤出、超声处理或其它技术等获得的基于细胞膜的囊泡。对于本领域技术人员显而易见的是，当描述细胞外囊泡的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个细胞外囊泡，即，可以包含数千个、数百万个、数十亿个或甚至数万亿个细胞外囊泡的细胞外囊泡群体。在本发明的具体实施例中，细胞外囊泡为外泌体。

20、本发明细胞或后续提到的能够分泌细胞外囊泡的细胞包括但不限于原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞、或基本上任何其它类型的细胞来源。本发明的细胞包括体内产生细胞外囊泡的细胞。根据本发明的细胞可以选自广泛范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(wharton'sjelly)、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞且更具体地说是任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞、骨髓抑制细胞、m2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别关注的细胞系包括人脐带内皮细胞(huvec)、人胚肾(hek)细胞、内皮细胞系例如微血管内皮细胞或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的msc、羊膜细胞、羊膜上皮(ae)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞例如b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(dc)也在本发明的范围内，并且基本上能够产生细胞外囊泡的任何类型的细胞也包括在本文中。通常，细胞外囊泡基本上可以源自任何细胞来源，无论是原始细胞来源还是永生化细胞系。细胞外囊泡源细胞可以是任何胚胎的、胎儿的和成年的体干细胞类型，包括诱导多能干细胞(ipsc)和通过任何方法衍生的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对于待治疗的患者而言，细胞本质上可以是同种异体的、自体的、甚至异种的，即细胞可以来自患者本人或者来自无关的、匹配的或不匹配的供体。

21、在一些实施例中，术语“外泌体”是一种由细胞分泌的，直径为30～150nm的磷脂双层囊泡小体，膜上和囊泡腔体内携带母细胞的多种核酸、蛋白质、脂质和代谢物，是细胞间通讯的介质。外泌体可以由所有类型的细胞分泌，在血浆、尿液、精液、唾液、支气管液、脑脊髓、母乳、血清、羊水、滑膜液、泪液、淋巴液、胆汁和胃酸中均有发现。外泌体的形成由细胞膜内陷形成早期的内涵体开始。这些早期内涵体可以与其他细胞器发生物质交换或者与不同的内涵体之间融合，进一步形成细胞内多囊泡体。多囊泡体之后与细胞膜融合，释放到胞外形成外泌体。不同细胞分泌携带不同组分的外泌体。外泌体具有高度异质性，表现为其大小，内含物，功能，以及细胞来源的不同。微环境和母细胞固有的生物学特性可能会影响外泌体的含量及其生物标志物。外泌体可能含有膜蛋白、细胞膜和核蛋白、细胞外基质蛋白、代谢物和核酸，即mrna、非编码rna和dna等。外泌体对受体细胞的影响可能因其细胞表面受体表达的不同而不同，这种功能异质性可能导致一组外泌体诱导细胞存活，另一组诱导细胞凋亡，而另外的一组外泌体则诱导不同靶细胞类型的免疫调节等。同时，不同的器官和组织来源的外泌体，呈现不同的特性。以上各种特征组合，使得外泌体可能具有更高的复杂性和异质性。外泌体释放到细胞外后，在组织液中移动到邻近的或者远处的受体细胞。这些外泌体被受体细胞吸收后，通过物质交换释放内含物实现物质和信号的交流。这种物质和信息传递可以通过外泌体上的跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子，激活细胞内信号级联；也可以通过与受体细胞的细胞膜融合，将外泌体的内含物送入受体细胞中；或者通过内吞作用进入受体细胞中。外泌体作为细胞间的通讯途径，其功能影响着广泛的生理过程，如免疫反应，组织修复、干细胞维持，心血管疾病，神经变性，癌症和验证等病理过程。

22、在一些实施例中，外泌体来源于造血干细胞、间充质干细胞和自然杀伤细胞中的至少一种。本发明不限制提供的外泌体保护剂适用的外泌体来源，任何细胞分泌的外泌体，或者来源于任何体液的外泌体均可使用上述保护剂进行保护。

23、在一些实施例中，术语“缓冲体系”是指存在于组合物或溶液中的组分，其可提供针对由强酸或碱引起的ph的显著变化的抗性。缓冲体系可包含单一试剂或多于一种试剂，例如弱酸及其共轭碱。缓冲体系可通过与组合物或溶液中的强酸或强碱的相互作用来提供针对显著ph变化的抗性，从而至少部分地防止组合物或溶液的ph显著变化。在本发明的具体实施例中，使用的缓冲体系为pbs缓冲剂，提供7.3的溶液ph，其为药用辅料，渗透压与生理盐水相近，适合静脉注射。

24、在一些实施例中，术语“糖”包括单糖和寡糖。单糖是一种不能被酸水解的单体碳水化合物，包括单糖及其衍生物，如氨基糖。糖类通常呈d构象。单糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脱氧核糖、神经氨酸。寡糖是由多于一个的单体糖单元组成的碳水化合物，其通过一个或多个糖苷键连接，可以是支链或直链。寡糖中的单体糖单元可以是相同的或不同的。根据单体糖单元的数量，寡糖是二糖、三糖、四糖、五糖等等。与多糖不同，单糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖。

25、在一些实施例中，术语“表面活性剂”是一类能够使两种液体间、液体与气体间、液体与固体间的表面张力或界面张力显著降低的化合物。表面活性剂在日常生活和工业生产中有着广泛的应用，他们具有乳化、分散、增溶、发泡、去污等多种作用，并且一些特定类型的表面活性剂还具有抗菌作用。表面活性剂类型多样，包括但不限于吐温、dmso或f68。在本发明的具体实施例中，选用表面活性剂f68作为外泌体保护剂，在外泌体的储存过程中起到了很好的保护作用。

26、在一些实施例中，术语“保护剂”指的是药学上可接受的赋形剂，它可以保护不稳定的活性成分(如外泌体)在冻干过程、随后的储存和重建过程中不受去稳定条件影响。保护剂包括但不限于糖类、多元醇(如糖醇)、氨基酸或表面活性剂。在特定的实施方式中，保护剂可选自糖类，如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸、氨基糖，例如葡糖胺、半乳糖胺、n-甲基葡糖胺(“葡甲胺(meglumine)”)，多元醇如甘露糖醇和山梨糖醇，以及氨基酸如精氨酸和甘氨酸或其混合物。

27、在一些实施例中，外泌体保存过程中影响外泌体变性的主要因素有：由于物理(非共价)相互作用或者化学凝集(共价)造成的蛋白质凝聚；氧化反应；水解作用等，虽然冻干的生物活性因子中含有极少量的水分，但在保存过程中仍然会发生水解作用；所以，为了防止外泌体在冷冻干燥和保存过程中变性或者失活，需要添加有效的保护剂，以稳定外泌体的活性。冻干保护剂的种类繁多，机制复杂，如果保护剂添加不当，不仅不能有效对外泌体进行保护，甚至在外泌体冻干粉的后期使用中会产生毒性等较大负面影响。而且，保护剂添加的浓度也对保护剂的保护效果起着非常重要的作用，通常，在某个浓度范围内，保护剂的保护作用随着浓度的升高而增大，当达到某一浓度时，保护作用达到最大值，而此后再增大保护剂的浓度，则保护剂的保护效果不再显著增加，过高的浓度甚至会使得冷冻干燥过程中外泌体发生变性；但是不同保护剂的保护机制不一样，呈现最大保护作用的浓度也不同，实际使用时，需要考虑多种保护剂的综合效果。在本发明的具体实施例中，提供了一种通用型的外泌体保护剂，其由表面活性剂f68和pbs缓冲剂组成，或由表面活性剂f68、蔗糖和pbs缓冲剂组成；其中，f68、蔗糖在pbs缓冲剂中的终浓度分别为0.005％和1.5％。

28、本发明第二方面提供一种细胞外囊泡制剂。

29、进一步，所述制剂包括本发明第一方面所述的保护剂和细胞外囊泡。

30、进一步，所述细胞外囊泡制剂类型包括溶液、冻干粉、悬浮液、凝胶或纳米颗粒。

31、在一些实施例中，细胞外囊泡制剂包括外泌体制剂，外泌体制剂的类型除了常见的溶液和冻干粉外，还包括其它几种形式，包括但不限于：活体化的外泌体(这种类型的外泌体是将外泌体悬浮在液体基质中，以保持其在储存、运输和使用过程中的活性)、微球装载的外泌体(利用微球装载外泌体，以实现外泌体在体内的缓释效果)、凝胶制备的外泌体、特定载体复合的外泌体(如与脂质体、纳米颗粒等复合)。需要注意的是，在基于细胞外囊泡保护剂公开的情况下，本领域技术人员可使用任何方法将本发明公开的保护剂和细胞外囊泡组装成任何制剂类型；因此，利用本发明公开的保护剂制成的任何细胞外囊泡制剂类型均在本发明的保护范围内。

32、本发明第三方面提供如下任意一种应用。

33、进一步，所述应用包括：

34、1)本发明第一方面所述的保护剂在制备细胞外囊泡制剂、含细胞外囊泡药物中的应用；

35、2)本发明第一方面所述的保护剂在细胞外囊泡储存中的应用；

36、3)本发明第一方面所述的细胞外囊泡制剂在制备药物或药物载体、化妆品中的应用。

37、本发明第四方面提供一种细胞外囊泡冻干制剂的制备方法。

38、进一步，所述方法包括：冻干包含细胞外囊泡和本发明第一方面所述的保护剂的混合体系。

39、进一步，本发明第一、第二、第三和第四方面所述的细胞外囊泡为外泌体。

40、优选地，外泌体的细胞来源为间充质干细胞。

41、在一些实施例中，术语“间充质干细胞”是指干细胞家族中的一项重要成员，其来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。其中，术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。

42、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

43、(1)本技术发明的保护剂用料更简化；

44、(2)本技术发明的保护剂是一种通用型保护剂，兼容-80℃、2-8℃以溶液形式保存，同时适合冻干；

45、(3)新保护剂选择的pbs、f68、蔗糖均为药用辅料，渗透压与生理盐水相近，适合静脉注射；

46、(4)新保护剂能有效保护高浓度外泌体，对于5×1010颗粒/ml的高浓度外泌体保护效果良好。