一种用于试剂红细胞长期保存的冰冻和解冻方法与流程

本发明属于红细胞保存，尤其涉及一种用于试剂红细胞长期保存的冰冻和解冻方法。

背景技术：

1、abo血型在输血医学中至关重要，abo不相容输血可能导致严重后果，因此临床输血前的abo血型检测是关键环节。然而，随着输血学的发展，发现了许多abo亚型，这些亚型由于基因突变导致的糖基转移酶功能异常，使得抗原表达弱或出现正反定型不符等现象。市场上现有的抗体检测试剂对常规abo血型检测效果良好，但对abo亚型的检出能力差异较大，主要由于不同厂家的抗体克隆株对抗原表位的识别不同。为了提高对abo亚型和稀有血型的检出能力，建立试剂红细胞库以质控血型检测试剂显得尤为重要。

2、目前，红细胞的保存方法主要有两种：液态冷藏和冰冻保存。液态冷藏通常在2～8℃条件下保存，但保存期短(2～3个月)，后期溶血严重，易出现假阳性结果。冰冻保存通过高渗透压冻存保护液(如甘油)减少冰晶形成，将红细胞保存于-80℃或液氮中，可保存十年或更长，但解冻过程繁琐，细胞得率低。

3、现有冰冻保存技术存在诸多问题，如高浓度甘油降低冰点，导致细胞在-20℃无法完全冰冻，缩短保存期限；解冻过程中，去除大分子物质时使用大量生理盐水，容易造成红细胞膜破裂，影响细胞得率。此外，液氮超低温保存尽管效果好，但存在危险性且运行成本高，不适合广泛应用。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于试剂红细胞长期保存的冰冻和解冻方法。

2、本发明是这样实现的，一种冰冻红细胞保存液，由等渗的磷酸盐缓冲液，包括以下组分：0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，枸橼酸钠1.6％，氯化钾0.03％和30～35％含量的甘油。

3、本发明还提供了一种梯度降温冻存红细胞的方法，该方法是：将新鲜红细胞压积用市场在售的红细胞保存液洗涤1-2次，用上述冰冻红细胞保存液与压积红细胞体积比1:1加入，颠倒混匀，室温放置约10min平衡后置4℃放置约1h，再置于-20℃过夜，后置于-60℃以下冰箱长期储存。所述商品化红细胞保存液，其特征在于：等渗的溶液，含糖类成分，能为细胞提供能量；含抑菌成分，能抑制微生物生长。

4、本发明还提供了一种简便的解冻红细胞的方法，该方法原理是：用一种专用的半透明膜，将冰冻红细胞置于袋内，浸入缓冲液中，红细胞被截留在袋内，而甘油、小分子物质不断扩散透析到袋外。

5、进一步，所述红细胞解冻方法：

6、1)路径1：

7、准备材料：9％氯化钠溶液、2.5％氯化钠溶液、0.9％氯化钠溶液、红细胞保存液；

8、室温解冻，采用梯度洗脱法，待冰冻红细胞在室温环境下完全解冻，量取溶解后的总体积，以1:1的比例缓慢加入9％氯化钠溶液，混匀、离心弃上清；

9、用2.5％氯化钠溶液和压积红细胞按6:1体积比洗涤2～3次至上清澄清；

10、用0.9％氯化钠溶液和压积红细胞按6:1体积比洗涤2～3次至上清澄清；

11、用红细胞保存液和压积红细胞按6:1体积比洗涤1次，离心结束后弃去上清；

12、用红细胞保存液配成3％和1％浓度的试剂红细胞；

13、2)路径2：

14、准备材料：md34透析袋mw:8000-14000、塑料夹子、塑料盒、2.5％氯化钠溶液、1.6％氯化钠溶液、0.9％氯化钠溶液、红细胞保存液；

15、室温解冻，采用透析法，待冰冻红细胞在室温环境下完全解冻，移入透析袋内，浸入2.5％氯化钠溶液，室温放置1小时，期间每15分钟晃动一次或2～8℃环境下放置2小时；

16、取出，量取解冻后收集的总体积，以1:1的体积比加入1.6％氯化钠溶液，混匀、离心弃上清；

17、用0.9％氯化钠溶液和压积红细胞按6:1体积比洗涤1～2次至上清澄清；

18、用红细胞保存液和压积红细胞按6:1体积比洗涤1次，离心结束后弃去上清；

19、用红细胞保存液配成3％和1％浓度的试剂红细胞。

20、本发明还提供了一种用于试剂红细胞长期保存的冰冻和解冻系统，包括：

21、红细胞冻存系统，用于将红细胞进行冻存处理；

22、红细胞解冻系统，用于将冻存的红细胞进行解冻处理。

23、进一步，所述红细胞冻存系统包括：

24、红细胞处理设备，用于将新鲜红细胞样本置于血清学离心机中以1000g离心5分钟，分离上层血浆和白膜层，并与0.9％氯化钠溶液按体积比1:6混匀，洗涤红细胞和再次离心；

25、制备红细胞冻存液，精密称取300～350g丙三醇，0.3g氯化钾，16g枸橼酸钠，1.242g磷酸氢二钠，0.571g磷酸二氢钠，用纯化水溶解并定容至1l，储存于2～8℃；

26、红细胞冻存液添加设备，用于将红细胞与红细胞保存液按体积比1:6混匀，离心后再与冻存液按1:1比例混合，并进行一系列温度处理以最终保存于-60℃以下低温中。

27、进一步，所述红细胞解冻系统包括：

28、路径1解冻设备，包括室温解冻装置、9％氯化钠溶液、2.5％氯化钠溶液、0.9％氯化钠溶液、红细胞保存液的存储和处理设备；能够在室温环境下解冻红细胞，并通过梯度洗脱法逐步加入不同浓度的氯化钠溶液进行洗涤和离心，最终配成3％和1％浓度的试剂红细胞。

29、进一步，所述红细胞解冻系统包括：

30、路径2解冻设备，包括md34透析袋、塑料夹子、塑料盒、2.5％氯化钠溶液、1.6％氯化钠溶液、0.9％氯化钠溶液、红细胞保存液的存储和处理设备；能够在室温环境下解冻红细胞，并将红细胞置于透析袋内，甘油不断扩散到透析袋外、洗涤和离心，最终配成3％和1％浓度的试剂红细胞。

31、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

32、第一、本发明获得一条简单、便捷性冻存红细胞、解冻红细胞途径，使红细胞能长期有效冻存，且复溶后得率达80％以上，并保存红细胞表面抗原的稳定性。对于红细胞表面抗原的研究、复杂抗体的研究、建立特殊血型试剂红细胞库、各厂家血型定型试剂质量控制至关重要，也为红细胞血型血清学和基因型一致性评价奠定技术储备和重要资源。

33、第二，本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：此发明技术转化后，不仅仅能将实验室小规模的亚型红细胞、稀有血型红细胞制备转化成为商品化、市场化的试剂红细胞，更能变成其他红细胞试剂的常规生产方式。还可将此技术运用于不规则抗体筛选红细胞、谱细胞、质控品的试剂红细胞制备。能将红细胞长期储存，使得临床上发现的许多珍稀红细胞资源有效保存、充分利用。为建立abo亚型试剂库、稀有血型试剂库奠定技术基础。还可通过市场需求，有计划性制备试剂红细胞，也大大挺高了血液的利用率，减少了浪费。

34、红细胞冻存操作简单、方便，不需要其他特殊的仪器设备，可操作性强，可处理量大。冰冻红细胞保存液配制简单，无特殊化学成分，成本低廉。红细胞在-60℃环境下可保存长达10年或更长，保存期间仅仅需要低温冰箱运行成本。

35、独创透析法解冻红细胞，通过材料学原理最大程度去甘油，材料简单、操作方便，代替目前常规用的逐步降低红细胞洗涤液渗透压的方式，能最大程度上保持红细胞膜的完整性，提供高品质的试剂红细胞，减少试验时间，进而间接提高免疫血液学试验水平，对输血的有效性的以及血液学研究提供有利的支持。

36、本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：目前，血液免疫学实验技术离不开抗原抗体反应，血清学用到抗体试剂生产纯化方便，已大量商品化、标准化。而试剂红细胞原料必须来源于人体，无法用其他来源的物质替代，所面临的问题就十分复杂。主要问题是红细胞体内平均寿命120天左右，离体制备后效期35天。冰冻红细胞是长期保存红细胞的常规方式。但在后期解冻过程中，操作过程复杂且甘油残留多，尽可能去除甘油就需要高渗盐水和多次机械化洗涤，这就容易破坏红细胞，导致得率低，保存后期红细胞溶血快速，在常规血清学实验中易造成假阳性和细胞膜棘突黏连干扰实验结果，所以一般不采用解冻红细胞的方式来制备试剂红细胞。而本发明技术通过透析原理，将细胞截留在半透明膜内，最大程度上避免了细胞损伤。

37、本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：解决了细胞解冻去甘油过程中对细胞的伤害。在解冻过程中，人们一直研究添加解冻保护液来保持细胞膜内外渗透压的平衡，解冻保护液一般采用和冰冻保存液类似的配方，降低甘油或大分子的浓度，但忽略解冻过程是去添加的过程，这就需要后期更多的洗涤，对细胞伤害更大。血液免疫学是一个多专业的交叉学科，合理利用利用材料学可以事半功倍。

38、本发明的技术方案克服了技术偏见：本发明技术通过后期一系列的实验研究，克服了冰冻红细胞不能作为试剂红细胞的原料的技术偏见，通过后期研究，细胞膜完好，红细胞血型糖类抗原和跨膜蛋白类抗原均无明显减弱。冰冻、解冻红细胞可作为试剂红细胞制备的一种方式。

39、第三，本发明解决的现有技术的技术问题：

40、1.红细胞长期保存稳定性差：传统的红细胞保存方法在长时间存储过程中容易导致红细胞的活性和功能下降，影响其应用效果。

41、2.保存液配方不稳定：现有的保存液配方可能无法提供足够的保护，使红细胞在冻结和解冻过程中容易受到损伤。

42、3.解冻过程复杂且效率低：许多现有的解冻方法操作繁琐，步骤多，容易引入污染和误操作，影响红细胞的质量和安全性。

43、4.细胞损失率高：在冻结和解冻过程中，红细胞的损失率较高，导致最终获得的红细胞数量不足，影响实验或临床应用。

44、技术方案的显著技术进步：

45、1.提高红细胞保存稳定性：本发明通过优化红细胞冻存液配方，显著提高了红细胞在长期低温保存中的稳定性，减少了细胞的损伤和活性下降。

46、2.高效的红细胞冻存方法：本发明提出了一种系统化的红细胞冻存方法，采用多步洗涤和精确的溶液比例配置，确保红细胞在冻结过程中得到充分保护，大幅降低了细胞的损失率。

47、3.简化的解冻步骤：本发明提供了两种红细胞解冻路径(梯度洗脱法和透析法)，大大简化了解冻操作步骤，提高了解冻效率，同时有效减少了操作中的污染风险。

48、4.保持红细胞活性：通过改进的保存液和科学的解冻过程，本发明能够在解冻后保持红细胞的高活性和功能完整性，确保其在后续应用中的效果。

49、5.可控的解冻过程：本发明的方法允许通过调整溶液的浓度和比例，灵活控制解冻过程中的红细胞复苏速度和效果，提高了解冻过程的可控性和重复性。

50、本发明针对红细胞长期保存和解冻中的技术难题，提出了一系列改进措施，显著提升了红细胞保存和解冻的效果和效率。这些技术进步不仅提高了红细胞的稳定性和活性，还简化了操作步骤，降低了细胞损失率，为红细胞的长期保存和实际应用提供了更加可靠和高效的解决方案。