一种用于肾脏类器官的冻存液、制备方法及使用方法与流程

本发明涉及细胞与组织工程，具体涉及一种用于肾脏类器官的冻存液、制备方法及使用方法。

背景技术：

1、肾脏类器官是一种体外培育而成的具备三维结构的细胞复合体，能够模拟肾脏的复杂结构和功能，已成为疾病模型构建、药物筛选和再生医学研究的重要工具。肾脏类器官的冻存和复苏作为整个技术应用的重要环节，目前冻存多采用慢速冷冻法和玻璃化法，其中，慢速冷冻法采用低浓度的冷冻保护剂（cryoprotective agents, cpas），玻璃化法采用高浓度的冷冻保护剂，在冷冻和复苏过程中若有冰晶形成和溶解将会破坏细胞间的连接，导致肾脏类器官的三维结构崩解或功能丧失；冷冻保护剂包括二甲基亚砜和血清，二甲基亚砜虽然可以防止细胞冻伤，但对细胞和组织具有潜在毒性，可能导致细胞膜损伤、蛋白质变性和代谢紊乱，从而影响肾脏类器官的存活率和功能；血清虽然可以为细胞提供营养，但对来源于干细胞的肾脏类器官具有不可控的潜在分化影响，影响冻存后的复苏成功率。故而，有必要开发适用于肾脏类器官的冻存液及冻存方法，以提高肾脏类器官冻存的保存效果和冻存复苏的成功率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于肾脏类器官的冻存液、制备方法及使用方法，所要解决的技术问题是如何减少冻存后肾脏类器官的损伤。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、第一方面提供一种用于肾脏类器官的冻存液，按重量份计包括以下成分：

4、4.7～5.3份cs10细胞冻存液；

5、3.5～4.5份kosr血清替代物；

6、0.8～1.2份改良培养基；

7、其中，上述改良培养基包括rpmi 1640培养基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，上述rpmi1640培养基的重量是l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的3.5～4.5倍。

8、由于肾脏类器官冻存相较于普通细胞或干细胞冻存存在区别，具体区别如下：

9、(1)肾脏类器官的组织复杂性: 肾脏类器官具有复杂的三维结构和多种细胞类型（如足细胞、不同区域的肾小管上皮细胞等）；而普通细胞或干细胞冻存通常针对单一细胞类型；

10、(2)冻存介质：肾脏类器官的冻存需要优化的冻存介质，以保护多种细胞类型和组织结构，需要加入特定的保护剂以防止类器官结构的损伤；而普通细胞或干细胞冻存通常使用标准的冻存介质（如含有二甲基亚砜和血清的溶液）；

11、(3)保存时间:肾脏类器官的预期冻存时间可以达到数小时至数天，但目前技术仍有限制；而普通细胞或干细胞的冻存时间可以达到数年甚至更长。

12、基于以上冻存区别，向上述cs10细胞冻存液加入kosr血清替代物和改良培养基以稀释二甲基亚砜的浓度，使冻存液中的二甲基亚砜达到所需的最低浓度，既降低了冰晶的形成，又避免了二甲基亚砜浓度过高带来的细胞毒性；通过kosr血清替代物解决了血清对肾脏类器官不可控的分化影响。

13、此外，由于cs10细胞冻存液含有平衡盐溶液、抗氧化剂、糖类和蛋白质稳定剂等，这些成分共同作用于肾脏类器官，提供一个优化的冷冻环境，减少冷冻和解冻过程中细胞的损伤；平衡盐溶液有助于维持细胞内外渗透压的平衡，防止细胞因渗透压失衡而受损；抗氧化剂能够清除冻存过程中产生的自由基，减少氧化应激对细胞的损伤；糖类（如葡萄糖）作为能量来源，支持细胞在冻存期间的代谢需求；蛋白质稳定剂能够保护细胞内的蛋白质结构，防止其因冷冻而变性或降解。改良培养基含有丰富的氨基酸、维生素和无机盐，为肾脏类器官提供了必要的营养和环境支持，帮助细胞维持代谢活动和功能完整性，有助于其在冻存后的复苏和存活；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的添加有助于维持肾脏类器官在冻存期间的代谢活性，减少因代谢减缓而导致的细胞损伤。kosr血清替代物作为培养基补充剂，富含生长因子和营养物质，为肾脏类器官提供营养支持，有助于维持肾脏类器官的结构和功能完整性。

14、进一步的，按重量份计包括以下成分：

15、5份细胞冻存液；

16、4份kosr血清替代物；

17、1份改良培养基；

18、其中，上述改良培养基中rpmi 1640培养基的重量是l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的4倍。

19、上述细胞冻存液中的二甲基亚砜与基质溶液中的平衡盐溶液协同作用，有助于维持细胞内外渗透压的平衡，防止细胞因渗透压失衡而破裂；二甲基亚砜与kosr血清替代物中的生长因子和营养物质共同作用于肾脏类器官，为细胞提供必要的保护和支持，促进细胞在冻存后的复苏和生长。基质溶液中的抗氧化剂可以辅助kosr血清替代物中的生长因子，共同抵御冻存过程中产生的氧化应激损伤；基质溶液中的糖类和蛋白质稳定剂与改良培养基中的氨基酸等营养物质共同作用，为肾脏类器官提供全面的营养支持，有助于维持肾脏类器官的结构和功能完整性。kosr血清替代物与改良培养基中的营养物质相互补充，为肾脏类器官提供全面的营养支持，有助于肾脏类器官在冻存后的复苏和生长，维持其结构和功能的完整性。与现有技术中浓度为10%的二甲基亚砜相比，本发明减小了二甲基亚砜在冻存液中的浓度，二甲基亚砜浓度仅为5%，削弱了冻存液对于肾脏类器官的潜在细胞毒性；由于冻存液中不含血清成分，解决了冻存液对肾脏类器官的分化影响，提高了肾脏类器官冻存后的复苏成功率。

20、进一步的，上述改良培养基中l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的浓度为2mm。

21、第二方面提供一种冻存液制备方法，该方法用于制备上述的冻存液；

22、该制备方法包括以下步骤：

23、按比例4：1，取上述rpmi 1640培养基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，放入容器后混合均匀，得到改良培养基；

24、将上述改良培养基保存在温度为4℃的条件下；

25、在室温条件下，按比例5：4：1取出保存温度为4℃的cs10细胞冻存液、kosr血清替代物 和改良培养基，放入容器后混合均匀，得到冻存液。

26、先混合比例4：1的rpmi 1640培养基和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺制得改良培养基备用；由于cs10细胞冻存液中的二甲基亚砜浓度为10%；后通过添加kosr血清替代物 和改良培养基混合，降低二甲基亚砜的浓度，避免二甲基亚砜浓度过高带来的细胞毒性。将cs10细胞冻存液、kosr血清替代物和改良培养基保存在4℃条件下，确保了其在与其他成分混合前的稳定性；在室温条件下混合cs10细胞冻存液、kosr血清替代物 和改良培养基，有助于各成分的快速均匀分散，同时避免了低温对混合过程的影响。

27、进一步的，在室温条件下，混合上述cs10细胞冻存液、kosr血清替代物和改良培养基，得到冻存液的具体步骤包括：

28、上述cs10细胞冻存液和改良培养基按比例1：1，取保存温度为4℃的cs10细胞冻存液和改良培养基并放入容器，在上述容器中混合cs10细胞冻存液和改良培养基，得到第二混合溶液；

29、上述第二混合溶液和kosr血清替代物按比例1：1，取保存温度为4℃的kosr血清替代物并放入容器，混合kosr血清替代物和第二混合溶液，得到第三混合溶液；

30、上述第三混合溶液和cs10细胞冻存液按比例4：3，取保存温度为4℃的cs10细胞冻存液并放入容器，混合第三混合溶液和cs10细胞冻存液，得到第四混合溶液；

31、上述第四混合溶液和kosr血清替代物按比例7：2，取保存温度为4℃的kosr血清替代物并放入容器，混合第四混合溶液和kosr血清替代物，得到第五混合溶液；

32、上述第五混合溶液和cs10细胞冻存液按比例9：1，取保存温度为4℃的cs10细胞冻存液并放入容器，混合第五混合溶液和cs10细胞冻存液，得到冻存液。

33、基于上述cs10细胞冻存液添加改良培养基，不仅为冻存液增加营养物质，还起到稀释cs10细胞冻存液的作用，降低二甲基亚砜的浓度，避免二甲基亚砜浓度过高带来的细胞毒性；向第二混合溶液添加kosr血清替代物，不仅为冻存液补充营养物质，还起到稀释二甲基亚砜浓度，降低细胞毒性的作用；分多步添加cs10细胞冻存液和kosr血清替代物，旨在进一步均匀分散各成分，确保它们在冻存液中的均衡分布。

34、第三方面提供一种冻存液使用方法，上述制备方法制得的冻存液采用该使用方法；

35、该使用方法包括以下步骤：

36、将制得的上述冻存液注入容量为2ml的冻存管，每支冻存管注入800ul冻存液，得到待使用冻存管；

37、将肾脏类器官放入上述待使用冻存管，肾脏类器官与待使用冻存管内的冻存液接触，得到待冷冻冻存管；

38、将上述待冷冻冻存管放入梯度冻存盒，再将该梯度冻存盒放入-80℃超低温冰箱；上述肾脏类器官的温度降至-80℃后，将待冷冻冻存管转移至装有液氮的液氮罐中。

39、对上述冻存液进行分液处理，800ul的冻存液通常能够提供适当的细胞密度，有助于提高细胞在冷冻和解冻过程中的存活率；此外，在冷冻过程中，液体会结冰并膨胀，在2ml的冻存管中只加入800ul的液体能够预留一定的空间，防止冻存管因内部压力过大而破裂。将肾脏类器官放入待使用冻存管，使肾脏类器官充分浸润在冻存液中，确保肾脏类器官在冷冻过程中得到充分且全面的营养支持和保护，减少损伤。通过梯度降温的方式，使肾脏类器官逐渐适应低温环境，减少因温度骤降导致的细胞损伤，提高肾脏类器官在冷冻过程中的存活率，减少冰晶的形成和细胞结构的破坏；利用液氮的超低温环境，长期保存肾脏类器官，确保肾脏类器官在超低温下保持稳定，延长保存时间，同时减少因温度变化导致的细胞损伤。

40、进一步的，将上述待冷冻冻存管转移至液氮罐所用时长小于2分钟。

41、避免上述待冷冻冻存管长时间暴露于室温环境中，影响肾脏类器官的冻存效果。

42、上述肾脏类器官在-80℃超低温冰箱中已经达到了一个稳定的低温状态，如果转移时间过长，可能会导致温度波动，从而影响肾脏类器官的冷冻保存效果；控制在2分钟内完成转移，可以最大限度地减少温度波动，保持肾脏类器官在稳定的低温环境中；在-80℃下，肾脏类器官中的水分已经形成了稳定的冰晶结构，如果转移时间过长，冰晶可能会因为温度波动而重新排列或形成新的冰晶，从而对肾脏类器官造成损伤；快速转移至液氮罐可以保持冰晶结构的稳定性，防止冰晶重新形成导致的细胞损伤。细胞在低温下保持活性的能力是有限的，长时间的温度波动或暴露于非理想环境中可能会导致细胞活性下降，快速转移至液氮罐可以最大限度地保持细胞的活性，为后续的实验和应用提供更好的材料基础。此外，快速转移至液氮罐还可以减少因长时间暴露于非液氮环境而导致的其他潜在风险，如污染、氧化等，这些因素都可能影响肾脏类器官的保存质量，因此快速转移有助于提高整体的保存效果。

43、进一步的，在得到上述待使用冻存管后，根据冻存液的等待使用时间确定待使用冻存管的保存温度，具体步骤包括：

44、预设上述冻存液配制完成时间为初始时间，将肾脏类器官放入待使用冻存管的时间为使用时间，使用时间与初始时间的差值为等待使用时间；

45、若上述等待使用时间小于30分钟，则将待使用冻存管置于室温；

46、若上述等待使用时间大于30分钟且小于24小时，则将待使用冻存管置于4℃；

47、若上述等待使用时间大于24小时，则将待使用冻存管置于-20℃。

48、冻存液等待使用时间较短，冻存液中的成分和稳定性不会受到显著影响，因此将待使用冻存管置于室温环境中，既可以方便后续操作，又不会对肾脏类器官的冻存造成不利影响；随着等待时间的延长，冻存液中的某些成分可能会开始发生微妙的变化，如蛋白质的变性或某些化学物质的降解，将待使用冻存管置于4℃环境下可以减缓这些变化的速度，从而保持冻存液的稳定性和有效性；此外，4℃的温度还可以防止细菌和其他微生物的生长，确保冻存液在长时间等待过程中的卫生安全。当等待时间超过24小时后，室温下冻存液中的成分会发生显著变化，甚至失去对肾脏类器官的保护作用,将待使用冻存管置于-20℃可以进一步减缓成分变化的速度，并延长冻存液的保存时间。

49、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

50、基于以上冻存区别，向上述cs10细胞冻存液加入kosr血清替代物和改良培养基以稀释二甲基亚砜的浓度，使冻存液中的二甲基亚砜达到所需的最低浓度（仅为5%），既降低了冰晶的形成，又避免了二甲基亚砜浓度过高带来的细胞毒性；通过kosr血清替代物解决了血清对肾脏类器官不可控的分化影响。

51、此外，由于cs10细胞冻存液含有平衡盐溶液、抗氧化剂、糖类和蛋白质稳定剂等，这些成分共同作用于肾脏类器官，提供一个优化的冷冻环境，减少冷冻和解冻过程中细胞的损伤；平衡盐溶液有助于维持细胞内外渗透压的平衡，防止细胞因渗透压失衡而受损；抗氧化剂能够清除冻存过程中产生的自由基，减少氧化应激对细胞的损伤；糖类（如葡萄糖）作为能量来源，支持细胞在冻存期间的代谢需求；蛋白质稳定剂能够保护细胞内的蛋白质结构，防止其因冷冻而变性或降解。改良培养基含有丰富的氨基酸、维生素和无机盐，为肾脏类器官提供了必要的营养和环境支持，帮助细胞维持代谢活动和功能完整性，有助于其在冻存后的复苏和存活；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的添加有助于维持肾脏类器官在冻存期间的代谢活性，减少因代谢减缓而导致的细胞损伤。kosr血清替代物作为培养基补充剂，富含生长因子和营养物质，为肾脏类器官提供营养支持，有助于维持肾脏类器官的结构和功能完整性。

52、由于冻存液中不含血清成分，解决了冻存液对肾脏类器官的分化影响，提高了肾脏类器官冻存后的复苏成功率。